猪伪狂犬病的PCR诊疗专家讲座

试验七猪伪狂犬病PCR诊疗猪伪狂犬病的PCR诊疗第1页试验目标：1、了解PCR反应原理、方法及操作步骤；2、掌握猪伪狂犬病毒PCR检测方法；试验内容：1、讲述PCR反应原理、方法及操作步骤，2、猪伪狂犬病毒PCR检测。猪伪狂犬病的PCR诊疗第2页什么是PCR？聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应原理、方法及操作步骤猪伪狂犬病的PCR诊疗第3页PCR原理PCR是一个选择性扩增DNA或RNA方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不一样温度下双链和单链能够相互转变性质，人为地控制体外合成系统温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目标DNA得以快速扩增。猪伪狂犬病的PCR诊疗第4页PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、适当Buffer等条件下，用耐热Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤重复循环（2530次）过程，使目标DNA呈指数扩增。猪伪狂犬病的PCR诊疗第5页反应程序变性：93-94℃2min变性：93-94℃30s复性：55-65℃30s延伸：72℃30s延伸：72℃2min35个循环猪伪狂犬病的PCR诊疗第6页PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension猪伪狂犬病的PCR诊疗第7页PCRproduct猪伪狂犬病的PCR诊疗第8页标准PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul猪伪狂犬病的PCR诊疗第9页猪伪狂犬病的PCR诊疗第10页酶及其浓度当前有两种TaqDNA聚合酶供给天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个经典PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引发非特异性扩增，浓度过低则合成产物量降低猪伪狂犬病的PCR诊疗第11页引物引物是PCR特异性反应关键PCR产物特异性取决于引物与模板DNA互补程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增猪伪狂犬病的PCR诊疗第12页引物在线设计网址：/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi猪伪狂犬病的PCR诊疗第13页猪伪狂犬病的PCR诊疗第14页猪伪狂犬病的PCR诊疗第15页PCR产物分析凝胶电泳分析法

可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。猪伪狂犬病的PCR诊疗第16页二猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒猪伪狂犬病的PCR诊疗第17页猪伪狂犬病的PCR诊疗第18页使用方法猪伪狂犬病的PCR诊疗第19页注意