肿瘤靶向性药物个体化治疗李智

肿瘤靶向性药物个体化治疗李智第1页/共56页人类基因组计划(HGP)：1996-2003

确定人类基因组所携带的全部遗传信息，并确定、阐明和

记录组成人类基因组的全部DNA序列

细胞染色体细胞染色体蛋白质生命的分子40-60万亿细胞每个细胞:染色体：46条DNA：2m碱基对：30亿（A,T,C,G）编码基因：3万（编码执行生命功能的所有蛋白质）第2页/共56页人类基因组研究人类基因组计划，1996完成人类基因组的常染色体测序.Nature2004;431(7011):931-945.国际人类基因组单体型图计划，2005旨在确定和编目人类遗传的相似性和差异性。利用HapMap获得的信息，研究人员将能够发现与人类健康、疾病以及对药物和环境因子的个体反应差异相关的基因。目标是通过比较不同个体的基因组序列来确定染色体上共有的变异区域Nature2005:437(7063):1299-1320DNA元素百科全书

(ENCODE)计划2003建立人类基因组1%目的基因中生物功能关键性元素目录

Nature2007;447(7146):799-816千人基因组计划，2008国际千人DNA测序.查出千个人中基因组的差异Science2008;319(5863):395Source:U.S.DOE(),HumanGenomeProjectInformation第3页/共56页美国FDA批准的靶向性治疗药物方框内药物为美国FDA要求和推荐检测药物分子靶标的遗传变异情况。药物名称商品名称分子靶点药物性质针对肿瘤类型帕尼（Panitumucetumab)维克替比（Vectibix）曲妥珠（trastuzumab)贝伐（bevacizumab)利妥昔（rituximab)替伊莫（ibritumomabtiuxetan)托西莫（tositumomab-I131）吉妥（gemtuzumabozogamicin）almtuzumab伊马替尼（imatinibmesylate)吉非替尼（gefitinib)埃罗替尼（erlotinb)舒尼替尼（sunitinb)索拉非尼（sorafenib)硼替佐米（bortezomib)赫赛汀(Herceptin)阿瓦斯丁（Avastin)美罗华（Rituxan)泽娃灵（Zevalin)Bexxar麦罗塔（Mylotarg)坎帕斯（Campath)格列卫（Gleevec)易瑞沙（Iressa)特罗凯（Tarceva)Sutent多吉美（Nexavar)万珂（Velcade)EGFRHER-2(c-erB2)VEGFRCD20CD20CD20CD33CD52BCR-ABL、KIT、PDGFREGFREGFRVEGFR、KIT、FR、FLT3VEGFR2、PDGFR28SproteasemAbmAbSMISMISMISMISMImAbmAbmAbmAbmAbmAbSMI结直肠癌、头颈鳞状细胞癌乳腺癌白血病非小细胞肺癌非小细胞肺癌、胰腺癌胃肠间质瘤、肾癌肾癌多发性骨髓瘤结直肠癌B细胞淋巴癌B细胞淋巴癌B细胞淋巴癌急性粒细胞白血病B细胞慢性淋巴细胞白血病胃肠间质瘤、慢性粒细胞B-raf、FLT3西妥昔（cetuximab)爱必妥（Erbitux）EGFRmAb结直肠癌、头颈鳞状细胞癌第4页/共56页肿瘤靶向性治疗药物作用机制临床研究处在的EGFR类靶向药物：H447、MDX210（双能EGFR抗体，嵌合CD64抗体）。目前由超过20种EGFR抗体药物正在研发中；小分子靶向治疗药物:吉非替尼、埃罗替尼和依马替尼分别作用于EGFR和c-KIT受体。第5页/共56页肿瘤靶向性药物个体化治疗检测临床应用西妥昔、帕尼疗效预测吉非替尼、埃罗替尼疗效预测伊马替尼疗效预测曲妥珠单抗疗效预测第6页/共56页肿瘤靶向性药物个体化治疗一、K-ras基因检测与结直肠癌靶向性药物治疗第7页/共56页CRC靶向性药物治疗

结直肠癌（CRC）靶向药物治疗：

--EGFR（epidermalgrowthfactor）抑制剂：小分子化合物和EGFR抗体

--血管生成抑制剂：VEGFR抗体（贝伐单抗Bevacizumab）

EGFR抗体：

--Cetuximab

（西妥昔单抗）：鼠源性嵌合型抗体

--Panituximab(帕尼单抗）：人源化抗体

临床研究表明，anti-EGFR靶向治疗可使CRC患者生存期延

长1倍（无基因突变）

当患者EGFR信号通路出现基因突变时，anti-EGFR可能抗

体不起作用。第8页/共56页KRAS蛋白BRAF蛋白AA细胞分化细胞凋亡增殖迁移血管增生PTEN蛋白10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因蛋白磷酸肌醇3激酶EGFR信号传导通路第9页/共56页

EGFR相关基因突变与EGFR抗体疗效EGFR：

突变频率：10~15%

疗效：没影响？更好？BRAF：

突变频率：8~10%

疗效：可能相关PI3K：

突变频率：10~15%

疗效：相关与否？PTEN：突变频率：10~15%疗效：相关与否？RAS原癌基因： 突变频率：KRAS~40%；NRAS3~5%；HRAS0~1% 疗效：KRAS与疗效密切相关；NRAS？

HRAS？第10页/共56页KRAS基因突变的影响KRAS基因状态：野生型、突变型野生型的KRAS蛋白由上游EGFR活化而导致短暂激活，其后迅速失活。KRAS

激活/失活效应是受控的。突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。第11页/共56页KRAS基因突变与EGFR用药指针第12页/共56页KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关JClinOnoclogy26(3):1374-9,2008

A.无进展生存期B.总体生存期西妥昔治疗组间疗效比较第13页/共56页西妥昔单抗仅可在野生型个体中改善总体生存率NEnglJMed359;17October23,2008KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关AMutationKRASBWild-typeKRASOverallSurvival(%)MonthsafterRandomizationMonthsafterRandomizationOverallSurvival(%)西妥昔治疗与对照支持疗法疗效比较第14页/共56页NEnglJMed359;17October23,2008KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关AMutationKRASBWild-typeKRASProgression-freeSurvival(%)Progression-freeSurvival(%)MonthsafterRandomizationMonthsafterRandomization西妥昔单抗仅可在野生型个体中改善无进展生存率第15页/共56页KRAS基因突变种类

基因点突变—最常见方式，多发生在

codons12，13，61密码子上KRAS基因突变96%发生在12、13号密码子上G12D(35G>A):12号密码子编码甘氨酸突变成天门冬氨酸为最主要形式

GGT

GGCGT12号密码子13号密码子

G/c/t/aG/c/t/aT

G/c/t/aG/c/t/aCGT12号密码子13号密码子第16页/共56页K-ras突变种类及频率12：GAT12：GTT13：GAT第17页/共56页K-ras突变总频率39%61%WTMutationInsufficientmaterial0%第18页/共56页石蜡包埋组织标本切片刮取切片或直接溶解（放在EP管里的标本）选取至少含50%肿瘤组织的切片试剂盒提取DNAKRAS基因突变检测流程DNA浓度检测（质控）目的片段扩增（生物素标记的PCR引物扩增）制备目的基因片段单链DNA模板上机检测与结果分析、发报告第19页/共56页KRAS基因突变检测送样要求若不能按上述操作提供样本，请提供10张标准不染色的石蜡组织切片石蜡包埋肿瘤组织块:石蜡包埋组织1块，常温保存、运输。剩余蜡块归还。石蜡包埋肿瘤组织切片：1.切片厚度10μm，8-10片。2.不需铺片和贴片，组织切片转移至小塑料离心管（EP管）。3.每管放5张面积约250mm2（成人拇指盖大小）的肿瘤组织切片。4.如果肿瘤组织切片的面积较小，请适当增加切片的数量（不超过12张）。5.送样时分装两管，用于检测和备份。6.样本常温保存、运输。第20页/共56页KRAS基因突变Pyrosequencing检测图谱12、13密码子分别为野生型：GGT和GGC12密码子为突变型：GAT12密码子为突变型：GTT12密码子为突变型：TGT13密码子为突变型：AGC13密码子为突变型：GAT第21页/共56页KRAS基因突变检测报告第22页/共56页二、非小细胞肺癌与EGFR基因突变检测肿瘤靶向性药物个体化治疗第23页/共56页EGFR–非小细胞肺癌治疗重要靶标TKTKATPATP细胞增殖细胞凋亡血管生成基因转录翻译细胞周期进程+非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)组织与正常组织比较与更高的EGFR表达.EGFR–对肿瘤的增殖、分化、迁移等作用起重要作用.对EGFR的抑制可阻断下游的信号传导活性.EGFR抑制药没有严重的毒性反应.放化疗抵抗细胞迁移扩散第24页/共56页NSCLC靶向治疗药物晚期NSCLC单药治疗

Gefitinib&Erlotinib:Cetuximab单药或与伊立替康联合用药治疗转移型结直肠癌、研究表明也可用于晚期NSCLC治疗

Gefitinib250mgO.D.oralErlotinib150mgO.D.oralCetuximab400mg/m2i.v.→200mg/m2i.v.wkly剂量第25页/共56页---85%~96%的突变为分别发生第19（缺失突变）和第21（L858R-亮氨酸>精氨酸）的突变，少部分发生在20号外显子，极少部分发生在18号外显子---与EGFR-TKI反应活性相关EGFR突变主要发生洛氨酸激酶域EGFR基因主要突变LynchTJ,etal.NEnglJMed.2004;350(21):2129-2139第26页/共56页EGFR基因主要突变EXON18EXON19EXON20EXON21EXON22EXON23EXON24G719X4%DelE746-75023%DelE746-751insS12%DelE746-753insS14%L858R39%L861Q1%S768I1%Exon20ins5%C790T1%19外显子突变占49%，21外显子突变占40%，20号外显子占7%，18号外显子突变只占4%。因此，通常检测EGFR突变只检测19、20、21号外显子或19、21号外显子。注：C790T为耐药突变，用药3至6个月后，须接受耐药突变，为是否继续用药提供参考。第27页/共56页A.无进展生存时间B.总生存时间Hanetal.JClinOncology23(11),2006EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效第28页/共56页基因突变位点突变功能用药建议EGFRDel（Glu746--Ala750）高反应性建议用此类药化疗Leu858Arg高反应性建议用此类药化疗酪氨酸激酶抑制剂(EDFRTKI):吉非替尼,埃罗替尼主要用于非小细胞肺癌。绝大多数非小细胞肺癌病人对吉非替尼无反应，但约10~15%

的病人对吉非替尼表现出快速，且非常显著的临床疗效。EGFR基因18-21号外显子编码酪氨酸激酶区，此段基因序列发生突变后会使EGFR被配体激活后磷酸化程度升高或持续激活下游信号通路，从而使TKI抑制剂吉非替尼的疗效更好。

EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效第29页/共56页EGFR突变与吉非替尼疗效突变者1年和18个月存活率者为90%和80%，而野生型分别为60%和40%第30页/共56页0612182430380255075100ProportionaliveLog-rankp=0.01EGFRexon19deletion(n=23)EGFRL858R(n=11)Months

19号外显子的缺失突变平均存活时间为34个月，大大长于21号外显子突变者的8个月，后者的存活时间也比野生型长。EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效第31页/共56页石蜡包埋标本切片刮取切片或直接溶解（放在EP管里的标本）选取至少含50%肿瘤组织的切片试剂盒提取DNADNA了浓度检测（质控）目的基因特异引物PCR扩增PCR产物纯化后上机Sanger法测序结果分析与发报告EGFR突变检测流程第32页/共56页EGFR突变检测标本送样要求石蜡包埋组织标本要求同前外周静脉非肝素抗凝血液---大量研究表明外周血DNA与肿瘤组织标本DNA的EGFR基因型的吻合率为76%~91%（Jonetal.JClinOncology26(35),2008---适用于：NSCLC晚期患者不能手术治疗者第33页/共56页用药建议EGFR基因19-21号外显子突变的纯合子或杂合子病人，建议使用含吉非替尼、艾罗替尼的化疗方案可以取得较好疗效，显著延长期生存期；无突变者不推荐使用酪氨酸激酶抑制剂。第34页/共56页EGFR突变检测报告第35页/共56页肿瘤靶向性药物个体化治疗三、胃肠间质瘤与c-Kit基因突变检测第36页/共56页胃肠间质瘤（gastrointestinalstromaltumors,GIST）胃肠道最常见的肉瘤：

--间叶源（结缔组织）性肿瘤

--占胃肠道肉瘤的80%GIST年发病率为14.5/100万，患病率为129/100万。1993年发现CD34为免疫组化标记物，1998年发现CD117为高特性标记物，并发现c-Kit基因突变。第37页/共56页GIST的免疫表型GIST中KIT的阳性染色（膜和胞浆以及核旁点状浓集）约95%的GIST

c-Kit

(CD117)阳性。GIST中其它阳性指标：--CD34(间叶/造血祖细胞标记物），阳性率60-70%。--平滑肌动蛋白，阳性率15-60%。--S-100，阳性率10%。GIST偶尔表达结蛋白。第38页/共56页c-Kit受体家族功能获得性c-Kit突变导致GIST、黑色素细胞功能障碍和皮肤肥大细胞增多症的发病率增高c-Kit受体：CD117、干细胞因子受体(SCFR)、肥大细胞生长因子受体(MGFR）受体结构：位于细胞膜上，为Ⅲ型酪氨酸激酶受体。细胞外有与配体干细胞因子（SCF）结合区域。细胞胞内区包括：2个酪氨酸激酶区和多个自身磷酸化位点。生理活性：KIT受体与干细胞因子结合后被激活（磷酸化），导致磷酸化级联反应，能够调节凋亡、细胞分化、增殖、趋化以及细胞黏附。第39页/共56页GIST治疗现状手术切除可能治愈，但复发转移率高（55%-90%）放射治疗不敏感，RR<5%。传统全身化疗：无效或<10%，未延长OS。支持疗法不能控制病情进展。目前内科药物治疗主要采用靶向性药物:--伊马替尼（Imatinib,格列卫），为复发、转移GIST的标准一线治疗药物

--舒尼替尼第40页/共56页伊马替尼作用机制伊马替尼作用于c-Kit蛋白，与c-Kit蛋白结合，占据了ATP在激酶区的结合位点。阻止底物的磷酸化及信号传导。信号传导阻滞，抑制了细胞的增殖与存活。可作用于多靶点:

--除c-Kit外，还有c-Ab1、Bcr-Ab1和PDGFR。第41页/共56页KIT基因突变Heinrichetal.HumPathol2002;33:484.细胞膜细胞浆Exon9:18.1%Exon11:66.9%Exon13:1.6%Exon17:1.6%JuxtamembraneDomainTK1DomainTK2DomainKinaseInsertKIT第42页/共56页c-Kit基因突变对伊马替尼敏感性的预测c-Kit第43页/共56页c-Kit基因突变与无事件生存时间（率）第44页/共56页c-Kit基因突变与总生存期（率）第45页/共56页耐药GIST治疗用药建议1、大部分肿瘤被伊马替尼控制，则继续用药。2、增加伊马替尼剂量至800-1000mg/d。3、加用舒尼替尼治疗。无突变患者：第46页/共56页肿瘤靶向性药物个体化治疗四、乳腺癌个体化药物治疗与HER-2第47页/共56页表皮生长因子受体家族及HER2生理学特性基因HER1(c-erB-1)HER2(c-erB-2)HER4(c-erB-4)HER3(c-erB-3)配体EGFTGF-αΒ-动物纤维素肝素结合生长因子双调因子神经调节蛋白神经调节蛋白?

HER2表达：胚胎期表达，成年正常组织中仅可检测到少量HER2蛋白，且基因为单