防风通圣丸中黄芩苷含量测定的不确定度评定

防风通圣丸中黄芩苷含量测定的不确定度评定目录TOC\h\z\t"标题1,1,标题2,2"摘要 I~II1前言 32材料与仪器 63方法 73.1色谱条件 73.2测量流程图 73.3测量步骤 84结果 84.1黄芩苷含量测定结果 84.2测量模型及不确定度来源分析 104.3合成标准不确定度表达式 134.4分量评定 134.5评定样品中黄芩苷的含量的重复性的标准不确定度 224.6合成标准不确定度的计算 234.7扩展不确定度的计算 234.8报告测量结果 235讨论 23参考文献 26综述 28致谢 36附录 37PAGE33PAGEI防风通圣丸中黄芩苷含量测定的不确定度评定摘要：目的评定采用高效液相色谱(HPLC)法测定防风通圣丸中黄芩苷含量的不确定度；方法建立防风通圣丸中黄芩苷含量测定的不确定度评定方法。采用高效液相色谱法，色谱柱为AgilentTCC18(4.6×250mm，5.0μm)；流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脱；流速为0.8ml/min；检测波长为280nm，对HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷含量的全过程进行分析，并对整个分析过程中的取样量、溶液的配制、所用分析仪器等影响因素引起的不确定度进行评定，根据各不确定度分量计算出合成不确定度并计算出扩展不确定度；结果防风通圣丸中黄芩苷的扩展不确定度为0.14(mg/g)，k=2；结论本方法适用于HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷浓度的不确定度评定。关键词：HPLC；防风通圣丸；黄芩苷；含量测定；不确定度AssessmentoftheUncertaintyofDrugContentDeterminationwithHPLCMethodAbstract：ObjectiveToAssesstheuncertaintyofbaicalindeterminationusinghighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodforthedeterminationofCompoundFangfengtongshengPillsSolution.MethodsToestablishamethodofbaicalininFangfengtongshengPillbyHPLC.BaicalinwasseparatedonAgilentTCC18(4.6×250mm，5.0μm)Columnusingmethanol-0.2%phosphoricacidasmobilephase，gradientelution，theflowvelocitywas0.8ml/minandUVdetectionwavelengthat280nm.Methods：ToanalyzeuncertaintyfactorsinthewholeprocessofbaicalindeterminationforCompoundFangfengtongshengPillsSolutionofbaicalinbyHPLC，processweighing，solutionpreparation，analyticalinstrumentsandotherfactorswereevaluatedforuncertaintyanalysis，uncertaintywascalculatedandextendedaccordingtoeachcomponent．ResultsTheexpandeduncertaintyofbaicalininCompoundFangfengtongshengPillsSolutionwas0.14(mg/g)，k=2.ConclusionThismethodisapplicabletoBaicalindeterminationuncertaintyevaluationofCompoundFangfengtongshengPillsbyHPLC．Keywords：HPLC，FangfengtongshengPills，baicalin，determination，uncertainty1前言在1993年，由7个国际性组织联合出版了《测量不确定度表示指南》（GUM）[1]，第一次对测量不确定度（measurementuncertainty）的定义、计算方法及结果表达方式进行了明确的规定。化学分析测量工作的目的就是要得到被测量对象的对应量值。测量结果的质量是评价其可信程度的重要依据。测量不确定度是衡量测量结果的质量，也是对测量结果的定量表述，不确定度的大小决定着测量结果的可信程度。所以，完整的结果表达必须包含被测量量的值和其不确定度。通常用来描述测量结果的准确程度会用到“误差”和“准确度”，如今我们引入了测量不确定度的概念，所以我们要明确“测量不确定度”与“误差”之间的区别：1、测量结果与真值之间的差叫误差，因此是个差值；而不确定度用于表示测量结果的分散性，因此是个区间。2、要得到误差的准确值十分困难，而且真值很难确定，所以一般用测量结果与平均值之间的差来表示；而不确定度可根据实验条件以及校准数据计算得到。3、由于误差是个差值，所以本身可正可负；而不确定度恒为正值。4、计算误差是没有考虑测量过程中的影响因素，只是测量结果与真值之间的关系；而不确定度的计算必须考虑实验过程中所有的影响因素，其表达的是测量结果的分散性。5、误差和不确定度的分类各不相同。误差分为系统误差和随机误差，而不确定度根据统计方法的不同分为A类不确定度评定和B类不确定度评定；能够用对测量值进行统计分析的方法来评定的不确定度称为A类不确定度评定，除A类不确定度评定以外的不确定度称为B类不确定度评定。6、若已知系统误差的估计值，可修正测量结果，但是不确定度则不能用来修正测量结果。[2]测量不确定度是与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性[3]，不确定度的大小决定着测量水平的高低，其值越小测量水平就越高，则测量结果的可信度越高，应用价值就越大，测量不确定度是报告结果表述的重要组成部分，可用于评估测量方法的实用性以及测量结果的可信程度。依据分析测量不确定度的作用途径，可大致归纳成以下几个方面：（1）用于测量结果的完整表述一个完整的测量结果的表述应该要包含不确定度的。因为它表明了其结果的分散性，可用于评估测量结果的可信度。（2）用于产品的合格判定合格判定必须要有完整的测量结果，而且是实验室测量工作中的一项重要工作。（3）用于评估实验室测量结果的水平不确定度能反应出实验环境与条件、人为因素、仪器设备条件等因素对实验结果带来的影响。是实验室测量水平的一种体现，因此可用于评估实验室的测量能力。（4）用于测量方法的改进和测量水平的提高通过测量不确定度的评定，找出影响测量结果准确性的主要因素，设法消除或加以控制，通过降低这些因素的影响，可以降低测量方法的不确定度水平，从而改进测量方法。不确定度水平的降低意味着提高了测量水平。除此之外，对于测量结果的不确定度大小也可反映出新方法和新仪器的可靠性。无论是在进行测量或者是评价测量方法的特性，都需要采用有效的质量保证和控制方法，以确保测量过程的稳定和处于受控的状态。质量要求和控制方法一般包括：资质合格的人员、仪器和试剂的正确维护校准、标准物质的使用、文件化的测量程序、使用适当的核查标准以及控制图。本文设计思路：1、选择一个规范的法定标准，即《中国药典》：本实验依据《中国药典》（2010年版第一增补本），原因是目前我国药品标准依旧有很多散件标准、地方标准等等，各种剂型、各个厂家、各个地方，质量标准参差不齐，《中国药典》是目前我国最权威的法定标准。2、选择使用具有代表性的方法——高效液相色谱法：高效液相色谱法是我国目前药品质量标准中常用的定量检测方法。本实验所使用的是美国WATERS公司生产的Alliance2998型高效液相色谱仪，其检测器为二极管阵列检测器，是目前各大检测机构常用的一型液相色谱仪，具有一定代表性。3、选择一个具有代表性品种：防风通圣丸是解表类中成药，具有解表通里、清热解毒的功效，由于现在我们的生活质量变好了，得肥胖症的人越来越多，所以对于肥胖症的关注程度也越来越高，而防风通圣丸常用于治疗肥胖症而且有着很好的疗效。该处方出自《宣明论方》，常用于治疗风热型感冒，症见鼻塞咽痛、咳嗽，还用于头痛、咽干、小便短赤、便秘、风疹和瘰疬[4]。处方由防风、薄荷、白芍、大黄、芒硝、滑石、甘草、黄芩、石膏等17味药组成[5]。方中黄芩泻火解毒、清热燥湿，其有效成分为黄芩苷[6]。根据药典，该处方药中黄芩里的黄芩苷是主要定量指标，黄芩作为清热燥湿药，更是广东省地区常用的中药材，因此我们选择黄芩中的黄芩苷作为不确定度评定，是具有一定的代表性。4、依据实验方法制定不确定度评定方案：根据计算公式建立测量模型→分析产生测量不确定度的原因→求出被测量的值→量化各不确定度的分量→合成不确定度的计算→扩展不确定度的计算→得出完整测量结果。[7-11]5、根据评定方案进行试验并对实验数据进行分析：依据《中国药典》(2010年版第一增补本)采用高效液相色谱法测定防风通圣丸中黄芩的有效成分黄芩苷的含量，其基本目标就是要达到结果的准确、一致。[12]但由于在实际测量中，真值难以达到，因此在最后给出量值的同时，必须还要给出对应的不确定度，否则该测量结果不具有可信度。所以在完成实验得到数据后，还要分析测量过程中所有可能对实验结果带来不确定度的情况。6、完成不确定度评定。根据之前所分析的在实验过程中所有可能对实验结果带来影响的将对其进行一一不确定度的量化计算，得到合成不确定度后计算扩展不确定度，给出可靠的完整测量结果。本实验过程主要依据《中国药典第一增补本》2010版一部防风通圣丸中的标准进行黄芩苷供试品与对照品的制备，然后用高效液相色谱法对其进行含量测定，并对检测结果进行不确定度评定与计算。预期结果为建立适用于评估HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷含量的不确定度的方法，来加强对黄芩苷含量测定的条件分析以及测量结果的可信度与准确性的认识[13]。制定药品质量标准的过程中，不仅要考虑其可操作性，更重要的是要找出不确定度的来源，因为要确保检测方法的可靠性、数据的可靠性、可控性与可比性。在分析测量过程中，不确定度的主要来源主要有取样量、溶液体积、玻璃仪器校准数据、分析仪器校准数据等[14]。一般认为，在取样以及制备样品过程中所带来的不确定度远大于化学分析所带来的不确定度[15]。因此对于评定药品检验中的测量不确定度，应该着重在检测方法、对其原理的了解以及对检测技术的熟练程度中找到不确定度因素的来源，掌握不确定度评估的基本原则和方法，达到在药品检验工作中的测量不确定度能全面评估，能正确得解释测量结果的不确定度[16]。目前，国际通行的测量不确定度评定文件是《测量不确定度表示指南》（GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement，以下简称GUM），我国将其等同转化为JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》。依据GUM，在1995年，EURACHEM与CITAC联合发布了指南性文件《分析测量中不确定度的量化》（QuantifyingUncertaintyinAnalyticalMeasurement），中国实验室国家认可委员会根据上述国际指南制定了CNAL/AR11:2003《测量不确定度政策》和CNAL/AG06：2003《测量不确定度政策实施指南》，用以指导化学、分析校准与检测实验室测量不确定度的评定工作。ISO有关标准物质的指南中，也将标准物质不确定度的相关内容列入，其基本概念和原理，与GUM一致。由此可以看出，国际、国内对于测量不确定度评定的基本理论，看法趋于一致，这对于不确定度的进一步研究打下了很好的基础[17]。由于目前国内药品行业不确定度评定空缺，对于数据可靠性范围无相应的数据说明，因此该实验的价值很大，对未来做药物检验相关工作具有重要意义。2材料与仪器材料①供试品：防风通圣丸（由深圳药检所提供）②标准物质：黄芩苷（中国药品检定研究院，含量：93.3%，批号：201318）仪器①电子天平（20141087）：型号：CPA225D，使用最大量程：100g，当称量0.01g左右时，允差限为：0.05mg，重复性允差限为：0.05mg。②电子天平（20141088）：型号：CPA225D，使用最大量程：220g,当称量值=0.5g左右时，允差限为：0.5mg，重复性误差：0.5mg。③高效液相色谱仪：（20110464）型号：Alliance2998，定量重复性限≤3.0%。④玻璃量器：经校准的移液管（5mL，B级）；经校准的容量瓶（10mL、50mL、100mL，均为B级）实验室环境温度：25～26℃3方法3.1色谱条件仪器：Alliance2998高效液相色谱色谱仪色谱柱：AgilentTCC184.6×250mm，5.0μm流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液流动相时间甲醇（A）0.2％磷酸溶液（B）0～30445630～3244→9056→1032～45901045～4790→4410→5647～604456流速：0.8ml/min检测波长：280nm3.2测量流程图①①对照品溶液的配制②供试品溶液的制备③用液相色谱仪测量对照品溶液和供试品溶液的色谱峰面积④用外标法计算样品的黄芩苷含量图1测量流程图3.3测量步骤①对照品溶液的配制：取黄芩苷对照品（中国药品检定研究院，含量：93.3%，批号201318）①0.01067g②0.01016g分别置100mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容，再分别精密量取5mL置10mL容量瓶中，70%甲醇定容即得。②供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取0.5g，精密称定，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。③测定：分别精密吸取对照品溶剂与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。4结果4.1黄芩苷含量测定结果表1对照品的浓度及测得的峰面积值组分样品名取样量mg稀释体积稀释后浓度(mg/mL)峰面积浓度与峰面积比值（f）黄芩苷对照品1-110.672000.0497817697072.8129E-08对照品1-210.672000.0497817738042.8064E-08对照品1-310.672000.0497817710742.8107E-08对照品2-110.162000.0474016846602.8136E-08对照品2-210.162000.0474016870042.8097E-08对照品2-310.162000.0474016796752.8220E-08平均17276542.813E-08RSD%0.19（附高效液相色谱图20张见附录A）表2供试品溶液重复性试验的测得值组分样品名取样量（g）稀释体积（mL)峰面积含量（mg/g）黄芩苷供试品1-10.49605023793636.746供试品1-20.49605023319236.612供试品2-10.51545025909597.069供试品2-20.51545025451036.944供试品3-10.51445026184347.158供试品3-20.51445026173547.155供试品4-10.50495024992226.961供试品4-20.50495023654956.589供试品5-10.51005026008617.172供试品5-20.51005025925467.149供试品6-10.51925025761546.978供试品6-20.51925025714266.965供试品7-10.50315024117976.742供试品7-20.50315024038376.719供试品8-10.52605026782727.160供试品8-20.52605026644707.124供试品9-10.52505026790437.176供试品9-20.52505026160567.007供试品10-10.53665027201807.129供试品10-20.53665027148217.115平均6.98RSD%2.82（附高效液相色谱图20张见附录C）4.2测量模型及不确定度来源分析4.2.1测量模型建立测量模型为：（1）式（1）中——考虑重复性修正量R影响后，供试品中黄芩苷的含量，mg/g；X——供试品中黄芩苷的含量，按式（2）计算，mg/g；R——为重复性修正量R，其值视为零，不确定度非零，mg/g。其中（2）式中：——供试品的进样浓度，mg/mL;——供试品的稀释体积，mL；——供试品的取样量，g。（3）式中——对照品的浓度，mg/mL;——供试品溶液峰面积，无量纲；——对照品溶液峰面积，无量纲；（4）则（5）则调整为（6）式（4）(5)（6）中——供试品中黄芩苷的含量，mg/g；——对照品取样量，g;——供试品取样量，g；——供试品溶液峰面积，无量纲；——对照品溶液峰面积，无量纲；——供试品溶液稀释体积，ml；——对照品稀释因子，（mL）-1；——对照品含量，%。实际计算按如下公式：定义：，f及fi的值（见表1）。4.2.2不确定度来源分析不确定度来源用因果图表示，见图2、图3。三图中七个主要不确定度来源的符号和含义与式（1）、式（5）一致。RR重复性XVXWX图2加入R后供试品溶液中黄芩苷含量的不确定度来源因果图图3供试品溶液中黄芩苷含量的不确定度来源因果图温度重复性XRWSVR温度重复性ωS天平误差天平示值重复性天平误差天平示值重复性AXAR仪器重复性仪器重复性示值允差示值允差4.3合成标准不确定度表达式由式（1）及不确定度传播率，考虑各个输入量无关，得：（7）式中：——为加入复现性影响后样品中黄芩苷含量的合成标准不确定度，mg/mL；——为样品中黄芩苷含量的标准不确定度，mg/mL；——为复现性的标准不确定度，mg/mL。4.4分量评定4.4.1评定样品中黄芩苷的含量的相对标准不确定度X由式（6）确定，式（6）为相乘形式的模型，各个输入量无关，依据JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》之公式（29），采用相对标准不确定度计算：（8）式中： ——为样品中黄芩苷含量的相对标准不确定度，mg/mL；——为对照品取样量的相对标准不确定度，g；——为供试品取样量的相对标准不确定度，g；——为供试品峰面积的相对标准不确定度，无量纲；——为对照品峰面积的相对标准不确定度，无量纲；——为供试品稀释体积的相对标准不确定度，mL；——为对照品稀释因子的相对标准不确定度，（mL）-1；——为对照品含量的相对标准不确定度，%。4.4.2对照品取样量的相对标准不确定度由天平允差引起的标准不确定度和天平重复性影响的标准不确定度合成。评定对照品取样量约为10mg，查CPA225D电子天平（仪器编号：20141087）检定证书，最大称量=100g时，量程为0～50g的允差绝对值限为0.05mg，认为矩形分布：评定依据JJG1036—2008《电子天平检定规程》规定：“5.5.2重复性:同一载荷多次称量结果间的差值，不得超过相应载荷最大允许误差的绝对值。”量程为0～50g的重复性限为0.05mg，认为矩形分布：评定因为由两个分量线性叠加，故：=（9）4.4.3供试品取样量的相对标准不确定度由天平允差引起的标准不确定度和天平重复性影响的标准不确定度合成。评定供试品取样量约为0.5g，查CPA225D电子天平（仪器编号：20141088）检定证书，最大称量=100g时，量程为0～50g的允差绝对值限为0.5mg，认为矩形分布：评定依据JJG1036—2008规定：“5.5.2重复性:同一载荷多次称量结果间的差值，不得超过相应载荷最大允许误差的绝对值。”量程为0～50g的重复性限为0.5mg，认为矩形分布：评定因为由两个分量线性叠加，故：=（10）4.4.4评定依据JJG705—2002（《液相色谱仪检定规程》）规定：“3.4.2定量测量重复性不得超过3.0%，认为矩形分布：由于对照品不同平行样及不同进样时的值略有不同，故取六次进样的平均值给赋值（见表1）。4.4.5评定 依据JJG705—2002规定：“3.4.2定量测量重复性不得超过3.0%，认为矩形分布：4.4.6评定对照品溶液稀释因子的相对标准不确定度其中（11）式中：——为对照品溶液的稀释因子，（mL）-1；——为使用5mL移液管量取的体积，mL；——为使用100mL容量瓶定容的体积，mL；——为使用10mL容量瓶定容的体积，mL。由式（11）确定，式（11）为相乘形式的模型，各个输入量无关，依据JJF1059.1—2012之公式（29），采用相对标准不确定度计算：（12）由5mL单标线吸量管最大允差引起的标准不确定度、移取溶液时由体积重复性产生的相对标准不确定度和温度效应引入的标准不确定度合成。由100mL容量瓶最大允差引起的标准不确定度、定容时由体积重复性产生的相对标准不确定度和温度效应引入的标准不确定度合成。由10mL容量瓶最大允差引起的标准不确定度、定容时由体积重复性产生的相对标准不确定度和温度效应引入的标准不确定度合成。移液管、容量瓶的体积重复性产生的相对标准不确定度不可忽视且因人而异，但本文已考虑了整个测量过程的重复性，故认为其体积的重复性含于整个测量过程的重复性标准不确定度之中。故（13）（14）（15）评定①评定查5mL单标线吸量管检定证书及根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，使用的B级5mL单标线吸量管允许绝对值为0.030mL，假定为三角分布：（mL）②评定实验在控温环境下进行，室温控制在（20±7）℃，与20℃的温差导致的定容溶液的体积膨胀大于单标线吸量管的体积膨胀，可只考虑定容溶液的体积膨胀，并认为定容溶液的体胀系数与有机溶液相近。有机溶液的体积膨胀系数为0.00013℃-1，因此控温范围产生的体积增量半宽为（5×0.00013×7）=0.00455（==0.00263（mL）根据公式（13）得（16）评定①评定查100mL单标线容量瓶检定证书及根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，使用的B级100mL单标线容量瓶允许绝对值为0.20mL，假定为三角分布：（mL）②评定实验在控温环境下进行，室温控制在（20±7）℃，与20℃的温差导致的定容溶液的体积膨胀大于单标线吸量管的体积膨胀，可只考虑定容溶液的体积膨胀，并认为定容溶液的体胀系数与有机溶液相近。有机溶液的体积膨胀系数为0.00013℃-1，因此控温范围产生的体积增量半宽为（100×0.00013×7）=0.091（==0.0525（mL）根据公式（14）得（17）评定①评定查10mL单标线容量瓶检定证书及根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，使用的B级10mL单标线容量瓶允许绝对值为0.040mL，假定为三角分布：（mL）②评定实验在控温环境下进行，室温控制在（20±7）℃，与20℃的温差导致的定容溶液的体积膨胀大于单标线吸量管的体积膨胀，可只考虑定容溶液的体积膨胀，并认为定容溶液的体胀系数与有机溶液相近。有机溶液的体积膨胀系数为0.00013℃-1，因此控温范围产生的体积增量半宽为（10×0.00013×7）=0.0091（==0.00525（mL）根据公式（15）得(18)评定根据公式（12）及（16）（17）（18）的结果得：、（19）4.4.7评定供试品溶液稀释体积的相对标准不确定度由50mL单标线吸量管最大允差引起的标准不确定度、移取溶液时由体积重复性产生的相对标准不确定度和温度效应引入的标准不确定度合成。其中体积重复性产生的相对标准不确定度不可忽视且因人而异，但本文已考虑了整个供试品溶液提取的复现性，故认为其重复性含于之中。故（20）评定查50mL单标线吸量管检定证书及根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，使用的B级50mL单标线吸量管允许绝对值为0.10mL，假定为三角分布：（mL）评定实验在控温环境下进行，室温控制在（20±7）℃，与20℃的温差导致的定容溶液的体积膨胀大于单标线吸量管的体积膨胀，可只考虑定容溶液的体积膨胀，并认为定容溶液的体胀系数与有机溶液相近。有机溶液的体积膨胀系数为0.00013℃-1，因此控温范围产生的体积增量半宽为（50×0.00013×7）=0.0455（==0.0263（mL）评定根据公式（20）得(21)4.4.8评定对照品含量的相对标准不确定度查黄芩苷对照品（中国药品检定研究院，含量：93.3%，批号201318）的证书，无相关的不确定度信息，且实验室目前无同类具有不确定度信息的对照品替代，故忽略。4.4.9评定样品中黄芩苷的含量的相对标准不确定度为阅读方便，将以上各数据整理列于表3：表3整理各分量值评定项目量值4.09×10-38.17×10-40.01730.01730.01246.87×10-3/根据公式（8）(22)4.5评定样品中黄芩苷的含量的重复性的标准不确定度为阅读方便，由表2获取复现性测量数据（见表4）表4供试品溶液重复性试验的测得值组分样品名取样量（g）稀释体积（mL)峰面积含量（mg/g）黄芩苷供试品1-10.49605023793636.746供试品1-20.49605023319236.612供试品2-10.51545025909597.069供试品2-20.51545025451036.944供试品3-10.51445026184347.158供试品3-20.51445026173547.155供试品4-10.50495024992226.961供试品4-20.50495023654956.589供试品5-10.51005026008617.172供试品5-20.51005025925467.149供试品6-10.51925025761546.978供试品6-20.51925025714266.965供试品7-10.50315024117976.742供试品7-20.50315024038376.719供试品8-10.52605026782727.160供试品8-20.52605026644707.124供试品9-10.52505026790437.176供试品9-20.52505026160567.007供试品10-10.53665027201807.129供试品10-20.53665027148217.115平均6.98RSD%2.82用贝塞尔公式计算标准差：（mg/g）样品黄芩苷含量测得值是以10份平行样的平均值给出的，故：（mg/g）（23）4.6合成标准不确定度的计算由式（7）、（22）、（23），得：（24）4.7扩展不确定度的计算依据JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，取k=2。按标准规定，测得值保留2位有效数字，故U取2位有效数字，则：4.8报告测量结果防风通圣丸中黄芩苷含量为：，k=2。5讨论从以上的结果可以得出：按《中国药典》（2010年版第一增补本）用HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷含量扩展不确定度为0.14（mg/g），即按照以上操作，今后测定结果的不确定度就可以给出。根据《中国药典》（2010年版第一增补本）修订后的要求，本品每1g含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于6.1mg。因此，本品符合质量要求。防风通圣丸为解表类中成药，具有解表通里、清热解毒的功效，该处方出自《宣明论方》，常用于治疗风热型感冒，症见鼻塞咽痛、头痛、咳嗽。处方由防风、薄荷、白芍、大黄、芒硝、滑石、甘草、黄芩、石膏等17味药组成。最近几年来，该药在临床应用有着很好的进展，在治疗肥胖症、高血压、急性化脓性中耳炎等外寒内热症上亦取得了一定的疗效[18]。防风通圣丸中药味较多，成分复杂，在《中国药典》（2010年版第一增补本）中对该药物的含量测定的研究对象规定为黄芩苷，有研究表明[19]，防风虽然为主药，但是在处方中的含量比较低，比例为3.8%，所以测定防风的含量并没有什么意义。而处方中的黄芩所占的比例比较高（7.5%），而且黄芩中黄芩苷的含量高达9.0%以上，故选择黄芩作为研究对象，并测定其主要成分即黄芩苷的含量，作为测定不确定度的研究指标，与药典相符合。对于提取方法，《中国药典》（2010年版第一增补本）中规定用70%的甲醇超声处理30min。参照文献[20-22]，对提取方法、提取溶剂、提取时间的考察，分别采用回流提取和超声来提取，分别使用50%乙醇、70%乙醇和70%甲醇等溶液作为溶剂，通过回流或超声提取黄芩苷30min或1h，实验发现用70%甲醇超声提取30min的提取效率相比于其他方法更高，因此与药典相符合。超声提取法是一种物理作用过程，通过超声波来提取药物的有效成分，能够对被提取物产生机械效应及热效应，通过增大分子的运动速率来提高其穿透力，从而达到提取药材有效成分的效果。而且该方法具有安全性好、无需加热、常压提取、操作简便、提取率高等优点[23]对于检测波长，《中国药典》（2010年版第一增补本）中规定检测波长为280nm，根据资料表明[24]，在210~400nm光谱区域对黄芩苷对照品进行扫描测定，结果在277.4nm波长处吸收最强。对于流动相，《中国药典》（2010年版第一增补本）中规定使用甲醇和0.2%磷酸溶液进行梯度洗脱。参考文献[25]，参照黄芩苷含量测定所常用的流动相系统，分别对甲醇-磷酸，甲醇-水-磷酸，甲醇-水-醋酸，乙腈-水-磷酸四个系统进行考察，通过对图谱峰型，保留时间，分离度，溶剂pH等综合比较分析，最终认为甲醇-水-磷酸作为最优流动相，也与药典中所规定的流动相相符合。但是药典中规定的是梯度洗脱，可能的原因是由于本品所含中药味较多，如果用固定比例的流动相，可能黄芩苷会得不到很好的分离，同时也会受到其他杂质的干扰，如果采用梯度洗脱，能达到更好的分离效果。由于在《中国药典2010年版第一增补本》中对于防风通圣丸进行了修订，其规定了高效液相色谱法含量测定的对象为黄芩苷，也对其色谱条件、对照品溶液的制备和供试品溶液的制备作出了相应的要求。而且本人通过收集了大量的资料后对不确定度评定方法有了基本的概念，因此想通过建立适用于评估HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷含量测定的不确定度的方法来巩固所学到的不确定度评定的知识。同时也是为了验证不确定度评定方法适用于该类中成药的测定结果的表达。综上所述，本文通过对HPLC法测定黄芩苷含量中不确定度分量的来源，并逐一进行分析和量化，可系统地评价防风通圣丸质量标准操作过程中的合成标准不确定度和扩展不确定度。为评价检测报告提供科学依据，为同类方法测量结果的不确定度评定提供了一种参考思路和模式[26]。由此不确定度分析，能使防风通圣丸中黄芩苷的含量测定确定更加科学、合理的质量评价方式。参考文献BIPM,ISO.GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement.Geneve：ISO，1995.2.张河战.测量不确定度及其在药品检验中的应用简介.中国药师，2004，7（12）：969-970.国家质量技术监督局.测量不确定度评定与表示指南[M].第1版.北京：中国计量出版社，2001:1.殷洁，高燕，赵渤年.防风通圣丸中黄芩最佳提取工艺的优选研究.食品与药品2014,16（2）：92.陈晓虎.HPLC法测定清开灵注射液中黄芩苷含量的不确定度分析.中国药房2007，18（15）：1168-1169.王本祥.现代中药药理学[S].天津：天津科学技术出版社，1997:299.化学分析中不确定度的评估指南[M]．北京：中国计量出版社,2000.王洁，葛雁．对化学检测实验室测量结果不确定度评定的探讨[J]．现代测量与实验室管理，2003，11(3)：26.郑建明，赵金伟．铁矿石总铁量测量不确定度的评估[J]．现代测量与实验室管理，2003，11(4)：23.GB／T15481—2000，测试和校准实验室能力的通用要求[S]．国家质量技术监督局，2000.康继韬，俞雪钧，李佐卿．气相色谱测定氯霉素残留量不确定度的评定[M]现代测量与实验室管理，2003，11(3)：17.SasakiS，KawaiK，HonjoY，eta1．Thyroidhormonesandlipidmetabolism[J]．NipponRinsho，2006，64(12)：2323—2329．孙莉.HPLC法测定双黄连口服液中黄芩苷含量的不确定度分析.现代中药研究与实践2009,23（3）：71-73.王洁，葛燕.对化学检验实验室测量结果不确定的探讨[J].中国卫生检验杂志，2010,20（8）：2099-2102.MICHEALH.RAMSEY.Sampingasasourceofmeasurementuncertainty:techniquesforquantificationandcomparisonwithanalyticalsources,JAnalAtomicSpec,1998,13:97-104.张河战.测量不确定度及其在药品检验中的应用简介[J].中国药师，2004,7（12）：969-971.化学分析测量不确定度评定指南//倪晓丽.北京：中国计量出版社，2008:3.杜之平.防风通圣丸质量评价性分析.北方药学，2013，10（11）：13.18尹珊珊，姚令文.HPLC法测定防风通圣丸中黄芩苷的含量.中国药事，2007，（11）：902-903.李强，李超，李启红，等．HPLC法测定双黄连口服液中黄芩苷的含量[J]．齐鲁药事，2010，29(8)：459．宋青，金芳，孟宪波．HPLC法测定茵芩口服液中黄芩苷的含量[J]．齐鲁药事，2011，30(9)：509．李华，周金祥．解毒祛疣合剂中黄芩苷的含量测定[J]．湖北中医杂志，2011，33(3)：72．黄贤荣，于燕莉，董淑荣.国内常用的黄芩有效成分提取分离方法简介.实用医药杂志，2012，29（3）：267-268.孙秋雁，宫立孟.高效液相色谱法测定消炎止痒洗剂中黄芩苷的含量.医药导报，2012，31（4）：512-513.刘弘.HPLC法测定消炎颗粒中黄芩苷的含量.实用医药杂志，2013，3（3）：237-238.汪麟，王清华.复方芩兰口服液黄芩苷含量测定的不确定度分析.黑龙江医药2014，27（4）：764-766.综述中成药中某成分含量的不确定度评定的研究现状1概述分析测量是社会、经济和科技活动的技术基础。无论是政府或组织，还是官员或百姓，都需要从分析测量中获得相关信息。为了解决特定的问题，人们每天都要进行成千上万的分析测量，用作行政执法、环境保护、医疗卫生、食品安全、工农业生产、能源开发和科学研究等方面决策的依据。分析测量已成为一些国家的基础性或先导性工作。著名科学家门捷列夫曾经说过：“没有测量，就没有科学”，而今天我们可以毫不夸张地说：没有分析测量，就没有人类的现代生活。显然，分析测量对于我们是多么的重要。化学分析测量的基本目标就是要达到结果的准确、一致。但由于在实际测量中，其真值难以达到，因此在最后给出量值的同时，必须还要给出对应的不确定度，否则该测量结果不具有可信度。所以，想要确保分析测量结果的准确性必须要对其不确定度进行评价。本文主要介绍了化学不确定度的研究意义、在药品检测领域中中药的检测方面的应用、研究背景、发展脉络，阐述了不确定度评定基础知识，探讨国内目前的研究水平、存在问题以及可能的原因，最后结合论文课题探讨对不确定度评定方法应用价值的看法。2不确定度的研究意义及在药品检测领域的应用2.1研究意义化学分析测量工作的目的就是要得到被测量对象的对应量值。测量结果的质量是评价其可信程度的重要依据。测量不确定度是衡量测量结果的质量，也是对测量结果的定量表述，不确定度的大小决定着测量结果的可信程度。因此，完整的结果表达必须包含被测量量的值和其不确定度。我们可以通过一个非常直观的“射箭打靶”实例来加以说明。射箭打在靶上的位置可分为以下几种情况：（1）假定受弓箭因素影响较小（即弓箭的准心已经校正），有些射箭手的命中点仍然偏离靶心，且分布相对分散一些，离散性大；（2）假定受弓箭因素影响较大（即弓箭的准心未经过校正，准心偏离），有些射箭手的命中点偏离靶心，且分布相对集中；（3）假定受弓箭因素影响较小（即弓箭的准心已经校正），有些射箭手的命中点靠近靶心，且分布相对集中，离散型性小。在通常情况下，影响射箭手射箭水平的因素有可确定因素和不可确定因素。可确定因素如弓箭准心的位置等；不确定因素如风向、风速、温度、气流等诸多环境因素的微小变化，以及射箭手在射箭时的心理生理变化等。通过以上的例子，我们可以清楚得了解到，影响到所有分析测量结果的准确性的因素可分为可确定因素和不可确定因素，其中可确定因素可采用某些措施来消除或引入修正量来修正，而且其大小是可以确定的。而不可确定因素的影响范围由于不能确定，只能采用估计的方法来确定。引入测量不确定度的概念目的就是为了表达客观存在的不确定因素对测量结果不确定程度的影响。换句话说，测量不确定度是从概率层面上表示被测量的真值落在某个量值范围内的一个客观描述。应该说，分析测量不确定度贯穿于分析测量的整个过程，不仅仅局限于测量方法、仪器设备的范畴，而是指用来对被测量赋值的操作过程、人为因素、仪器设备、计量器具和实验环境条件等要素的综合，是获得测量结果的整个过程。因此将不确定度理论引入测量系统分析，研究测量系统全过程中的动态变化规律，为科学地评价测量系统、测量过程及测量结果等提供重要的依据，具有很高的学术价值和实际意义。2.2测量不确定度在药品检测领域中中药检测方面的应用随着药品检测领域的发展，检测手段和检验方法的逐步完善，作为一种科学、合理的验证手段及质量控制方法，测量不确定度正越来越多的被引入药学领域[1]，而中药的化学成分非常复杂且含量较低，所以测量不确定度对于科学合理地评定测量结果具有重要意义。2.2.1中药材方面由于中药材质量分析所涉及到的各种实验仪器设备、人为因素和化学计量方法缺少可靠的科学依据，因此不确定度评定为中药材的质量分析提供了合理的评价指标。高永莉等[2]采用高效液相色谱法测定天麻素的含量，并建立了天麻中天麻素含量测定的不确定度评定方法。翁雪萍等[3]通过检测冰片中龙脑的含量，对其测量过程的不确定度来源及大小进行了分析与计算。张晓红等[4]对黄柏中盐酸小檗碱的含量进行了测定并对其各不确定度分量进行了相应的计算。2.2.2中成药方面中成药是通过一味或多味中成药加工而成，其化学成分复杂而且含量较低，剂型多样，制药难度较大，而通常检测的时候，样品的提取过程较多，伴随的误差较大。因此需要考虑的不确定度影响因素往往会比单味药检测复杂很多。林远凤等[5]分析了高效液相色谱法对三黄片中盐酸小檗碱含量进行测定过程中的不确定度。陈晓虎[6]分析了高效液相色谱法测定清开灵注射液中黄芩苷含量的不确定度来源，所建立的方法能够用于评定高效液相色谱法测定药物含量的不确定度。吴杰连等[7]分析高效液相色谱法测定利胆排石片中大黄酚和大黄素含量的过程中所带来的不确定度并对其分析计算，其建立的不确定度评定方法适用于片剂高效液相色谱法的含量测定。3不确定度的研究背景和发展脉络3.1研究背景原美国标准局（NBS）的数理统计专家埃森哈特在1963年研究“仪器校准系统的精密度和准确度估计”时就提出了测量不确定度的概念，并且引起了当时国际上的广泛关注。NBS在20世纪70年代研究和推广测量保证方案（MAP）时对测量不确定度的定量表述工作又有了新的进展。“不确定度”一词源于英语“uncertainty”，原意为不确定、疑惑等。是一定性表示的名词。现在用于测量结果的表达时，其含义则扩展成定量表示，即定量地表示测量结果的不确定程度。3.2不确定度的发展历史为了统一国际化测量不确定度的表示，1980年国际计量局在1980年征求了32个国家的建议后，发布了采用测量不确定度评定来表述测量结果的建议书。该建议书向世界各国描述了测量不确定度的基本原则与评定方法。第70届国际计量委员会（CIPM）在1981年展开，经过讨论最终同意通过了该建议书。国际计量委员会于1986年要求国际计量局（BIPM）、国际电工委员会（IEC）、国际标准化组织（ISO）、国际法制计量组织（OIML）、国际理论和应用物理联合会（IUPAP）、国际理论和应用化学联合会（IUPAC）以及国际临床化学委员会（IFCC）七个国际组织成立专门的工作组，开展测量不确定度评定的规范化指导性文件的起草工作。经过改工作组织近7年的努力，由ISO计量技术顾问组第三工作组（ISO/TAG4/WG3）起草，并与1992年以七个国际组织的名义联合发布了《测量不确定度表示指南》（GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement，简称GUM）和第二版《国际通用计量学基本术语》（InternationalVocabularyofBasicandGeneralTermsinMetrology，简称VIM）。1995年又发布了GUM的修订版，即《测量不确定度表示指南ISO1995》（GUM95）[8]。这两份文件为在全世界统一应用测量结果的不确定度评定和表示奠定了稳定的基础。除了以上七个国际组织外，国际实验室认可合作组织（ILAC）也已表示承认GUM。意味着确定了GUM在进行测量结果的不确定度评定的基础地位。以上这些国际组织几乎涉及到所有与测量相关的领域，可见文件GUM的权威性。可见，经过近三十年的努力，分析测量不确定度评定与表达的世界性趋势已经逐渐形成。由分析测量不确定度概念的提出，到不确定度评定与表述方法的应用，是计量科学界一个新的里程碑。这并不是一个简单的任务，也不是依靠少数几个科学家能够做到的，它汇聚了世界各国计量学家的经验和智慧，经受了时间的磨砺，通过不断的完善与改进，最后才促成了GUM这样系统又完整的文件的诞生。[9]4不确定度的概念测量不确定度是测量结果带有的一个参数，用以表征合理赋予被测量值的分散性。它是被测量真值落在某个量值范围内的一个评定。下面是几个常见的不确定度概念[10]：4.1标准不确定度u(xi)以估计标准差表示的测量不确定度，简称不确定度。4.2A