还原型谷胱甘肽专家讲座

欢迎各位院系：任课老师：姓名：还原型谷胱甘肽专家讲座第1页还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽专家讲座第2页菌株选育和发酵过程调控54还原型谷胱甘肽应用及市场前景312还原型谷胱甘肽性质与生理功效什么是还原型谷胱甘肽6还原型谷胱甘肽生产方法与工艺总结与展望主要内容还原型谷胱甘肽专家讲座第3页1.走近谷胱甘肽.什么是谷胱甘肽？谷胱甘肽(glutathione)是一个含γ-酰胺键和巯基生物活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，其中半胱氨酸上巯基为其活性基团。存在于几乎身体每一个细胞之中。而且广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最主要非蛋白巯基化合物之一。还原型谷胱甘肽专家讲座第4页产谷胱甘肽微生物1921年Hopkins在酵母中首先发觉谷胱甘肽。随即，谷胱甘肽化学结构得到确定。日本等国家首先开始了发酵法生产谷胱甘肽，因为不停改进和提升发酵工艺，逐步在日本国内实现了谷胱甘肽生产工业化，并使得微生物发酵法成为当前最普遍使用生产方法。自然界中能较多在细胞内累积谷胱甘肽微生物主要为酵母菌及革兰阴性菌。产谷胱甘肽酵母菌主要有：产朊假丝酵母(Candidautilis)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，面包酵母(Saccharomycescerevisiae)等。国内外利用细菌生产谷胱甘肽报道比较少，代表为：藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)，甲烷甲基单胞(Methylomonasmethanolvorens)，奇异变形杆菌(Proteusmirabiliss)。还原型谷胱甘肽专家讲座第5页谷胱甘肽分类

谷胱甘肽含有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用是还原型谷胱甘肽（GSH），只有还原型谷胱甘肽才含有生理活性，而生物体内氧化型谷胱甘肽需要还原后才能发挥其主要生理功效。所以我们日常所指谷胱甘肽普通为还原型谷胱甘肽。

还原型谷胱甘肽分子结构还原型谷胱甘肽专家讲座第6页两种谷胱甘肽之间关系，

氧化型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽2分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)在NADPH存在条件下，谷胱甘肽还原酶(GR)作用于GSSG还原生成GSH，反应中NADPH起源于葡萄糖磷酸戊糖路径；还原型谷胱甘肽专家讲座第7页2.还原型谷胱甘肽性质与功效还原型谷胱甘肽理化性质与结构特征分子式：C10H17N3O6S分子量：307.32348熔点：为189～193°C，晶体呈无色透明细长粒状，等电点为5.93。结构特征：GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经过肽键形成，分子中有一特殊

γ一肽键，即由谷氨酸γ—COOH与半胱氨酸α一NH2缩合成肽键，它不一样于蛋白质分子中普通肽键。GSH为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中则易被氧化。还原型谷胱甘肽专家讲座第8页GSH生物合成途经及代谢调控合成路径是在γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。L—谷氨酸，L

—半胱氨酸在γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteinesynthetase，GSHⅠ）作用下合成γ—谷氨酸半胱氨酸(γ-glutamylcysteine，γ一ECG)，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase，GSHⅡ)作用下与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽专家讲座第9页两步反应以下：

ATPATPL-Glu+L-CysL-γ-Glu-L-Cys+ADP+Pi（1）L-γ-Glu-L-Cys+GlyL-γ-Glu-L-Cys-Gly+ADP+Pi（2）还原型谷胱甘肽专家讲座第10页影响生物体内GSH合成主要原因包含GSHⅠ与GSHⅡ活性和ATP供给。前者主要影响生物合成效率，后者决定了生产成本。在GSH生物合成过程中直接添加ATP经济上不适当，所以在研究中需要引入有效ATP合成系统，与GSH合成系统耦合，提升效率降低成本。GSH在体内生物合成在GSHⅠ作用下进行，而且GSHⅠ受到谷胱甘肽产物反馈抑制，除此之外还受转录水平两个调整子Yap1P和Skn7P控制。与之相反，GSHⅡ保守不受调控。还原型谷胱甘肽专家讲座第11页还原型谷胱甘肽生理功效GSH分子含有γ—谷氨酰基和活性巯基，是GSH许多主要生理功效结构基础。GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质半胱氨酸残基处于还原状态。GSH还广泛存在于其它正常细胞中，有很强亲和力，能与各种化学物质及其代谢物结合，去除体内氧自由基及其它自由基，含有保护肝细胞膜、促进肝酶活性．抗氧化、解毒等作用，是人体细胞内主要代谢调整物质。GSH还在蛋白质和DNA合成、物质运输，酶活性、新陈代谢及细胞保护等生物学功效中起着直接或间接作用。它还是许多酶反应辅基，可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白巯基，去除体内过多自由基，参加体内三羧酸循环及糖代谢，含有解毒、预防糖尿病、癌症及消除疲劳等作用。还原型谷胱甘肽专家讲座第12页还原型谷胱甘肽药理作用还原型谷胱甘肽（GSH）激活各种酶【如巯基(-SH)酶等】，从而促进糖、脂肪及蛋白质代谢，并能影响细胞代谢过程；它可经过巯基与体内自由基结合，能够转化成轻易代谢酸类物质从而加速自由基排泄，有利于减轻化疗、放疗毒副作用，对化疗、放疗疗效无显著影响，如保护肾小管免受顺铂损害主要机制为肾小管细胞内含谷胱肽解毒时所需r-谷酰氨转肽酶，而癌细胞却无此酶，故在不影响GSH细胞毒效应同时保护了正常组织但器官。且对放射性肠炎治疗效果较显著；对于贫血、中毒或组织炎症造成全身或局部低氧血症患者应用，可减轻组织损伤，促进修复。经过转甲基及转丙氨基反应，GSH还能保护肝脏合成、解毒、灭活激素等功效，并促进胆酸代谢，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性维生素（A、D、E、K）。还原型谷胱甘肽专家讲座第13页3.还原型谷胱甘肽应用及市场前景三食品中应用一临床医药中应用四化装品中应用.二在抗辐射上应用

谷胱甘肽含有广谱解毒作用，不但可用于药品，更可作为功效性食品基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功效性食品广泛应用。GSH应用还原型谷胱甘肽专家讲座第14页还原型谷胱甘肽在临床药品上应用

当前，已人工研制开发出了谷胱甘肽药品，广泛应用于临床，除利用其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒外，还用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等，作为治疗或辅助治疗药品。近年来，西方科学家，尤其是日本学者发觉谷胱甘肽含有抑制艾滋病毒功效。最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶不平衡，起到抗过敏作用，还可预防皮肤老化及色素从容，降低黑色素形成，改进皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽。还原型谷胱甘肽专家讲座第15页还原型谷胱甘肽在抗辐射上应用辐射对生物体危害较大，长久接收射线辐照，轻易引发头昏乏力、记忆力减退，心悸失眠多梦，毛发脱落，皮肤干燥，骨关节酸痛，晶状体混浊、肝脏肿大、齿龈出血、咳嗽等。还原型谷胱甘肽是一个内源性放射防护物质，含量高，其放射敏感性差；含量低，其放射敏感性强。原因是因为还原型谷胱甘肽本身是一个射线保护剂，它可使射线经过直接作用和间接作用在生物体内产生高活性各种自由基，经过还原型谷胱甘肽作用后而淬灭。还原型谷胱甘肽专家讲座第16页还原型谷胱甘肽在食品中应用GSH广泛应用于食品领域，如加入酸奶和婴儿食品起类似维生素C稳定作用；预防水果罐头水果褐变；在面制品中起还原和强化氨基酸作用；缩短面包混揉时间；GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时含有肉类风味；GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品核酸分解，延长保鲜期以及提升奶酪质量，预防酪蛋白褐变。还原型谷胱甘肽专家讲座第17页还原型谷胱甘肽在化装品中应用绝大多数化装品中含有铅，在使用过程会刺激皮肤以及从容在皮肤上引发黑斑；当机体衰老时，体内各式各样自由基生成增多，自由基作为人体垃圾，是人体内主要内毒素之一。因为GSH能够去除自由基、能够螯合重金属等内外毒素，预防皮肤色素从容，预防新黑色素形成并降低其氧化，因而GSH适合用于延缓衰老而含有佳效。另外GSH化学本质是小分子肽，所以它外用是轻易透过细胞膜而被皮肤吸收，它作为化装品外用是很显效。同时，GSH作为小分子肽，它内服无须被消化即可吸收，所以GSH口服愈加有效。所以GSH不论内用还是外作都含有良好养颜、美容、回春之效。还原型谷胱甘肽专家讲座第18页还原型谷胱甘肽市场前景1.国产谷胱甘肽占主导地位

还原型谷胱甘肽（GSH）于1995年由日本协和发酵株式会社与日本山之内株式会社研制成功并上市。1999年，重庆药友制药粉针制剂在国内获批生产，随即，昆明积大制药、山东绿叶制药还原型谷胱甘肽注射剂先后上市。至年5月，国内已经有26张生产批文，全部为制剂，谷胱甘肽进口注册批文共有12张，。

当前，市场上还原型谷胱甘肽价格在4000/kg上下，国内谷胱甘肽原料药即使仍在研制开发中，据悉已经有突破性进展。谷胱甘肽原料大规模生产技术开发一直是国家大力扶持项目。还原型谷胱甘肽专家讲座第19页

年，国内22个城市样本医院销售注射用谷胱甘肽用药市场已达3．31亿元，增加率达12．05%（见图）。在这一市场中，国产还原型谷胱甘肽粉针剂占据了主导地位，其中重庆药友制药阿拓莫兰，上海复旦复华药业谷胱甘肽粉针剂，山东绿叶制药绿汀诺、昆明积大制药松泰斯，四家占据了83%市场份额。而进口品牌则分羹另外17%市场。从年样本医院统计数据分析，销售额超出千万元有12个城市（或地域）。用药量最大是上海，其次是北京、珠三角（除广州）、广州和杭州，前5个城市（或地域）占这一品种总体市场半壁江山，达51.39%。用药金额不足千万元另外10个区域累计占据了13.35%。还原型谷胱甘肽专家讲座第20页-年注射用谷胱甘肽市场销售额及增加率还原型谷胱甘肽专家讲座第21页2.用药领域不停拓展

临床显示，谷胱甘肽在减轻脑组织缺血-再灌注损伤方面显示出一定作用，可用于改进急性脑中风患者辅助治疗，对心脏含有保护作用。与此同时，谷胱甘肽也是一个疗效很好滴眼液，所以也为人工泪液、眼药水等药品提供了辽阔市场。同时，谷胱甘肽本药活性成份为还原型谷胱甘肽，它在细胞内参加氧化还原过程，起着SH酶赋活、辅酶作用，能预防紫外线诱发白内障，抑制角膜溃疡，并控制进行性白内障发展及视网膜病变。据某研究机构数据显示，年我国眼科用药销售额为61.65亿元，比上年同期增加了10%。销售药品仍以抗感染、抗干眼病、抗青光眼等为主。另外，谷胱甘肽作为生物活性强化剂，在食物添加剂领域使用也日益受到人们重视，国外已开发了相关功效性食品。还原型谷胱甘肽专家讲座第22页总而言之，谷胱甘肽是一个颇有市场前景品种，不但在抗肝炎病毒药、肝病辅助用药及眼科用药领域发挥了很好作用，而且医学界已开始研究其在心血管及循环系统中应用。伴随肽类物质研究不停深入，肽类物质含有神奇功效不停被发觉，谷胱甘肽将成为值得关注主要品种。还原型谷胱甘肽专家讲座第23页酶转化法发酵法化学合成法溶剂萃取法Vision01Vision03Vision02Vision044.还原型谷胱甘肽生产方法与工艺还原型谷胱甘肽专家讲座第24页化学合成法与萃取法提取GSH伴随多肽合成技术日趋成熟，现已能用化学合成法合成GSH，不过化学合成法生产GSH操作过程复杂、耗时且得到GSH是左旋体和右旋体混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价极难保持一致，所以难以推广。萃取法主要是从高含量谷胱甘肽动植物组织中提取所采取一个方法,它是发酵法生产流程中下游过程基础。能够从鼠血、鼠肝和鸡血、酵母、麦芽中提取GSH,但以酵母作原料居多。萃取法生产GSH所使用溶剂能够是水、有机酸溶液和稀醇等。但因为原料不易取得且GSH含量极低，所以该法实际应用价值不大。还原型谷胱甘肽专家讲座第25页微生物发酵法生产还原型谷胱甘肽发酵细胞破碎分离提取得到GSH微生物细胞内含有GSH，且发酵周期短、操作简单、成本低，发酵法就是采取廉价糖类原料，利用微生物体内物质代谢路径来进行GSH生物合成方法。基本工艺以下：普通情况下，微生物细胞中GSH含量不高（仅为干重0.5%~1%)，

过高含量GSH轻易破坏体内业已平衡氧化还原环境。发酵法产GSH关键问题在于怎样提升细胞密度以及细胞内GSH含量，二者有机结合将有利于GSH产量大幅度提升。还原型谷胱甘肽专家讲座第26页菌株选育采取常规诱变育种选育高产菌株利用遗传工程技术构建含有GSH合成酶活性基因工程菌细胞密度提升可经过对发酵过程优化控制（包含高密度培养）取得，而胞内GSH含量提升通常是由菌种选育来实现，主要有两种方法方法一方法二因为发酵法所使用细菌或酵母轻易培养，加之生产方法及工艺不停改进和完善，所以采取微生物发酵法已成为当前GSH工业化生产最普遍方法。还原型谷胱甘肽专家讲座第27页⑴常规诱变育种到当前为止,针对GSH生产酵母菌株而进行物理或化学处理方法大致有紫外线、X射线、γ射线以及亚硝基胍等,而培养基中特定筛选物质(筛子)主要包含蛋氨酸、L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、1,2,4三氮唑、氰化钠、亚硫酸盐、酰胺和靛酚等。经过一系列对菌株改良及选育工作,取得了很多GSH高产菌株。还原型谷胱甘肽专家讲座第28页还原型谷胱甘肽专家讲座第29页⑵构建工程菌构建含有GSH合成酶活性基因工程菌两种方法2.酵母基因重GSH在细胞内特殊生理功效使其对本身合成产生反馈抑制，用诱变伎俩和构建基因工程菌株来减弱或消除这种反馈抑制非常主要。近年颇受重视是将编码GSH合成酶系基因克隆到大肠杆菌或酵母中。1.E．coli基因重组还原型谷胱甘肽专家讲座第30页E.Coli基因重组方法E．coli菌种细胞中GSH含量虽较酵母少，但它遗传背景清楚、简单，基因操作方便，菌体繁殖较快。为了消除GSH对GSH合成酶Ⅰ(GSH-Ⅰ）反馈抑制，Murata从E．coli中筛选了1株GSH-Ⅰ脱敏突变株，从中克隆了GSH-Ⅰ基因(gshⅠ)并在E．coliBRC912表示，使此株GSH合成活性大为提升，产量达4．81pmol／g(湿细胞)。GSH-Ⅰ活性提升后，GSH-Ⅱ就成了合成GSH限速酶。沈立新等构建了含有gshⅠ和GSH-Ⅱ基因(gshⅡ)重组质粒，分别转入E．coli细胞，分步进行γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽合成，合成率达3．78g／L，比同时转入合成率高42．1％，既处理GSH-Ⅰ和GSH一Ⅱ在同一菌株中克隆表示相互影响矛盾，又处理了GSH对GH-Ⅰ反馈抑制，降低了ADP对第二步反应抑制程度。还原型谷胱甘肽专家讲座第31页②酵母基因重组方法酵母糖酵解产生ATP是GSH合成过程中不可少能量供体。利用基因工程伎俩增加酵母中GSH合成酶系活性是提升GSH合成率另一有效路径。Tazuka等将E．coliB中gshⅠ基因片段与S．cerevisiae981个开启子融合，融合GSH-Ⅰ在酵母中表示，结果GSH-Ⅰ活性和GSH含量分别提升了100多倍和3倍多。Christine将带有gshⅠ、gshⅡ各1个拷贝质粒PINEⅢ转化入啤酒酵母，GSH产量到达细胞总干重1．8％，大大高于对照菌株。另外，经过优化菌株培养表示条件也可提升GSH产量。有研究经过反馈控制乙醇浓度流加葡萄糖，利用正交试验设计优化发酵后期添加3种氨基酸配比和浓度进行酿酒酵母T65补料分批发酵生产GSH，产量到达2．19g／L。还原型谷胱甘肽专家讲座第32页

卫功元等研究了温度、pH、溶氧和补料流加速度对产朊假丝酵母生产GSH影响，发觉较高温度对细胞生长有促进作用，较低温度则更有利于提升GSH产量，pH5.5时对细胞生长和GSH合成均最正确，恒溶氧控制发酵可显著提升细胞干重和GSH产量，当恒溶氧浓度35％时，二者提升幅度可分别到达22％和30％，指数流加是较理想补料方式。经优化培养，GSH产量达857．2mg／L。除ECoti和酵母外，傅瑞燕等构建了重组乳酸乳球菌生产GSH，用乳酸链球菌素诱导4h后，胞内GSH含量到达358nmol／mg蛋白质。还原型谷胱甘肽专家讲座第33页培养基成份

碳源：

碳源作为满足微生物生长需要最基本营养要素，糖类物质成为研究重点。酵母菌能很好利用蔗糖、葡萄糖，也可利用木糖，但基本不利用乳糖。卫功元等对葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麦芽糖、果糖和可溶性淀粉等物质进行考查，结果显示蔗糖比较适适用于促进细胞生长，而葡萄糖更有利于促进GSH合成，所以选择葡萄糖作为碳源。还原型谷胱甘肽专家讲座第34页

氮源：氮源经过对牛肉膏，蛋白胨等有机氮源及硫酸铵，尿素等无机氮源比较得出单一无机氮源存在条件下，细胞生长及谷胱甘肽合成均优于有机氮源，尿素在8g／L时，谷胱甘肽产量(150mg／L)和胞内谷胱甘肽含量(2．82％)到达最高，而硫酸铵浓度在10L时，细胞生长(7．0g／L)最理想。刘娟

等在确定蛋白胨对融合菌株生产谷胱甘肽影响基础上研究了不一样浓度无机氮源硫酸铵、氯化铵及尿素，发觉均无显著影响。还原型谷胱甘肽专家讲座第35页前体：前体各种氨基酸均能促进酵母生长，提供必要营养物质，但却并非均能促进谷胱甘肽合成，所以学者研究在发酵过程加入适当百分比3种前体氨基酸使之既能促进酵母菌体生长又能促进谷胱甘肽生物合成。Wen等利用正交试验设计研究在S．cerevisiaeT65菌株培养基中添加最正确前体浓度为谷氨酸10mmol／L，甘氨酸18mmol／L，半胱氨酸3．35mmol／L，同时在培养过程中先加入2mmol／L半胱氨酸，再按最正确百分比加入前体，使得谷胱甘肽产量到达329．3mg／L。还原型谷胱甘肽专家讲座第36页发酵条件优化环境条件也是发酵法生产谷胱甘肽不容忽略主要原因,其中影响细胞GSH含量环境参数主要包含温度、溶解氧、pH等。温度直接影响代谢过程中各种酶活性,代谢反应速率,菌体生长量。卫功元等研究表明,较高温度能够降低底物对菌体生长抑制,有利于细胞生长,而低温更有利于谷胱甘肽生物合成。童群义等在重组大肠杆菌培养过程中提出了温度分阶段培养策略,即前期控制37℃培养菌体,后期降低温度增加酶生物合成。氧气浓度对细胞生长和GSH合成有显著影响,首先影响着微生物生长,另首先对用。卫功元等研究了发酵罐中溶氧对产朊假丝酵母对分批发酵生产GSH影响,当葡萄糖浓度为30g/L,且通气量控制在5L/min时,搅拌转速到达300r/min即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧需求。发酵液中pH对营养物质解离状态、酶活性、代谢速率有着主要影响,所以pH也是制约GSH生产一个关键原因。卫功元等研究了pH对谷胱甘肽发酵影响,结果表明,当pH值控制在5.5时谷胱甘肽总产量最高。

温度

溶解氧pH还原型谷胱甘肽专家讲座第37页发酵过程调控葡萄糖流加策略前体物质添加

发酵过程调控分两个方面还原型谷胱甘肽专家讲座第38页葡萄糖流加策略

GSH生成与发酵液中葡萄糖消耗亲密相关。研究发觉,只有在葡萄糖几乎耗尽、生长停顿时,细胞内才开始大量合成GSH;且因为GSH是胞内产物,所以在提升生产菌株胞内合成GSH能力同时,还需要在发酵过程中设法提升细胞数,以提升GSH总产量。为实现这一目标,必须加大底物(如葡萄糖)质量浓度。但过高葡萄糖浓度会产生葡萄糖

效应,抑制细胞生长而且目标产物得率会大大下降,所以普通采取后期限量流加葡萄糖方法,以消除底物抑制,到达高密度细胞培养、延长GSH生产时间目标。还原型谷胱甘肽专家讲座第39页1.恒速流加2.指数流加3.反馈控制流加当前应用最多葡萄糖流加策略有三个方面：还原型谷胱甘肽专家讲座第40页前体物质添加

在前体氨基酸中,半胱氨酸为GSH合成关键氨基酸,它存在能显著提升细胞内GSH含量及GSH比生产速率,但妨碍细胞量增加。在发酵过程中半胱氨酸补加策略应以尽可能降低对生长抑制为标准。普通有两种补加方式:(1)连续流加，保持发酵液中半胱氨酸浓度恒定。(2)定时补充。当发酵进行到比生长速率基本稳定时，加入少许高浓度半

胱氨酸溶液。加入时间选择在发酵第2阶段刚开始时。

还原型谷胱甘肽专家讲座第41页酶工程法合成GSH用分离提取酶或游离细胞进行催化反应，降低了细胞代谢副产物对分离提取影响，简化了下游工艺。早期研究中用去污剂和溶壁酶处理啤酒酵母增大细胞通透性，加入含有葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等前体反应液，GSH产量大大增高，达9.06g/L。也有些人将经甲苯通透处理后重组E.coli与干酵母细胞一起加入反应体系，GSH含量达5mg/mL。因为游离酶难以重复使用，并影响产物分离提取，故用固定化酶催化合成GSH。将自溶后啤酒酵母分离出GSH合成酶，用聚丙烯酰胺凝胶包埋后加入反应液，半胱氨酸转化率为87％（游离酶为47％），且稳定性提升。还原型谷胱甘肽专家讲座第42页用固定化细胞法含有特定优势，这是因为：（1）GSH合成酶是双酶体系，酶分离提取愈加繁琐，用固定化细胞催化合成GSH防止了繁杂酶分离过程；（2）GSH合成过程需ATP作能量供体，实际生产过程中不可能直接加入ATP，而且ATP利用后生成ADP对GSH-Ⅰ及GSH-Ⅱ有抑制作用，所以，提供适当ATP再生体系不论从经济角度还是从酶反应角度均较为合理。ATP再生由酶系完成，固定化细胞能够利用对应菌株细胞内ATP再生酶系和GSH合成酶系，经过偶联或与其它GSH合成酶活性较高菌株固定化细胞种间联合成GSH，其优势是固定化酶法合成GSH无法比拟。还原型谷胱甘肽专家讲座第43页GSH不一样合成方法比较与偶联与固定化酵母生产GSH相比，含GSH合成酶系重组E.coli含有稳定性好、成本低廉等优点，但须处理GSH合成过程中ATP再生问题。已经有许多ATP再生方法和GSH酶反应偶联合成GSH。利用E.coli细胞乙酸激酶GSH合成酶系，以乙酰磷酸为磷酸供体将ADP等再生为ATP，合成GSH，偶联效果很好。但乙酰磷酸成本较高且不稳定，难以工业化生产。沈立新等用卡拉胶固定E.coli生产GSH，优化条件下罐式反应器GSH产量为0.84g/L，稳定性很好；另外，与酵母生产ATP体系相偶联共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24g/L，收率比直接加入ATP提升24.2%。童群义等将E.coli与啤酒酵母用PVA-卡拉胶混合载体固定生产GSH，比单一固定E.coli或单一固定