重组基因医学知识讲座专家讲座

第十八章重组DNA技术

生物化学教研室：周赛男1重组基因医学知识讲座第1页基因重组(geneticrecombination)

是指在体外用酶学方法将不一样起源DNA进行切割、连接，组成一个新DNA分子过程，又称DNA重组。基因克隆(genecloning)

将重组DNA分子导入到适当受体细胞中，使其扩增和繁殖，以取得大量同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(geneticengineering)

是将不一样起源DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表示，也称重组DNA技术。2重组基因医学知识讲座第2页

本章主要内容主要工具酶基因克隆惯用载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中应用3重组基因医学知识讲座第3页第一节主要工具酶工具酶

基因工程中工具酶主要包含用于DNA和RNA分子切割、连接、聚合、逆转录等相关各种酶类。4重组基因医学知识讲座第4页一、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类由细菌产生能专一识别双链DNA结构中特异碱基序列，并在特定位点进行切割内切酶，简称限制酶。

依据限制酶作用特征，普通分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中惯用是Ⅱ型限制酶。命名：HindIII属种株同一株具不一样特异性酶5重组基因医学知识讲座第5页

限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割47个bp长度且含有回文序列DNA片断，主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或钝端

回文序列(palindrome)是指该部位核苷酸序列呈180O反向重复;

粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出碱基序列相互间含有互补性。6重组基因医学知识讲座第6页⑴产生5'-粘性末端

⑵产生3'-粘性末端7重组基因医学知识讲座第7页⑶产生平(头末)端/钝端8重组基因医学知识讲座第8页

惯用限制性核酸内切酶特征微生物名称酶名称识别次序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ9重组基因医学知识讲座第9页

限制性内切酶应用

经过切割不一样起源DNA双链特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端、长度不一样DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。10重组基因医学知识讲座第10页主要工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异碱基序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成cDNA碱性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶

催化3'-端合成同聚尾11重组基因医学知识讲座第11页第二节基因克隆惯用载体载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运输到宿主细胞运载工具。其化学本质为DNA分子。

本节主要内容

载体必须具备基本条件载体分类惯用载体12重组基因医学知识讲座第12页一、载体必须具备基本条件⒈含有独立复制能力⒉具备多个限制酶识别位点(多克隆位点)⒊含有遗传表型或筛选标识⒋有足够容量以容纳外源DNA片段⒌可导入受体细胞。13重组基因医学知识讲座第13页二、载体分类*（一）克隆载体

用来克隆和扩增DNA片段载体。

有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。（二）表示型载体为了使插入外源DNA能够表示为多肽链而设计载体称为表示型载体。表示型载体除需载体必备条件外，还需对应开启子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表示调控构件。14重组基因医学知识讲座第14页三、惯用载体

（一）质粒(plasmid)：

是存在于细菌染色体外、能自主复制双链环状DNA分子。

作为克隆载体质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高拷贝数；2.含有1个以上遗传标志，便于筛选；3.含有多克隆位点。

15重组基因医学知识讲座第15页

总而言之，质粒载体应该是一个分子量较小、高拷贝“松弛型”质粒，且含有一个以上遗传标志和多克隆位点质粒。广泛应用质粒：

pBR32质粒、pUC系列等16重组基因医学知识讲座第16页

pBR322质粒①4363bp②含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).17重组基因医学知识讲座第17页pUC系列质粒

由pBR322和M13噬菌体构建而成双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和与M13噬菌体相同多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coliLacZ基因片断,编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选18重组基因医学知识讲座第18页(二)λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基互补单链，是天然粘性末端，被称为COS位点。19重组基因医学知识讲座第19页

λ噬菌体两种生长路径（示意图）20重组基因医学知识讲座第20页

λ噬菌体感染细菌后两种生长路径

溶菌性生长噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来噬菌体又可感染其它细菌。

溶源性生长噬菌体感染细菌后，可将本身DNA整合到细菌染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。21重组基因医学知识讲座第21页

第三节重组DNA基本原理（DNA重组基本程序包含以下过程）

分—获取目标基因和载体接—目标基因与载体连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA筛选与判定22重组基因医学知识讲座第22页一、目标基因获取（分）目标基因是指所要研究或应用基因，也是需要克隆或表示基因。

目标基因起源

1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应4）人工合成基因23重组基因医学知识讲座第23页（一）制备基因组DNA（基因文库，genomiclibrary

）分离、纯化基因组DNA

在EDTA等存在下，用蛋白

↓RE酶K消化细胞、酚抽提；大小不一样酶切片段

惯用蔗糖梯度离心或电泳

↓

分离酶切片断；分别与一样RE酶切载体连接惯用噬菌体载体或质粒载体

↓DNA连接酶连接；

导入宿主细胞、扩增导入宿主细胞内培养、扩增；

↓得到分子克隆混合体用分子杂交等方法进行判定、（基因文库）筛选、再扩增，分离、回收。24重组基因医学知识讲座第24页（二）制备cDNA（cDNA文库）

分离目标基因mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA与载体连接，导入宿主细胞扩增→构建cDNA文库。25重组基因医学知识讲座第25页（三）聚合酶链反应(PCR)

在体外，以目标基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNAPol等存在下，组成一个反应体系。经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤重复屡次循环（2530次），扩增目标基因.

（四）人工合成基因

应用DNA测序仪测出某一基因碱基序列，或依据某一蛋白质氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪经过化学合成原理合成目标基因。（普通先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段）26重组基因医学知识讲座第26页二、目标基因与载体连接（接）

（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法27重组基因医学知识讲座第27页

（一）粘性末端连接

将目标基因和载体用同一个限制酶酶切，产生相同粘性末端，再经过DNA连接酶作用将二者连接起来，组成重组DNA分子。

（二）平头末端连接

有些限制酶只能将目标基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶作用下一样能连接起来。28重组基因医学知识讲座第28页（三）人工接头法合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。29重组基因医学知识讲座第29页（四）同源多聚尾连接法30重组基因医学知识讲座第30页三、重组DNA导入宿主细胞（转）

无性繁殖

体外重组后DNA导入受体细胞，然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆

从上述无性繁殖细胞中深入筛选出含目标DNA重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞进行无性繁殖时所采取受体细胞.31重组基因医学知识讲座第31页

重组DNA导入宿主细胞类型转化

以质粒作载体构建重组体导入受体细胞过程；转染

以病毒作载体构建重组体导入受体细胞过程；转导

以噬菌体作载体构建重组体导入受体细胞过程。

感受态细胞

用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接收外源DNA能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。32重组基因医学知识讲座第32页四、重组DNA筛选与判定（筛）（筛选含重组体阳性菌落，普通有以下几个方法）

1）平板筛选2）限制酶切图谱筛选3）PCR筛选重组体4）原位杂交技术插入失活蓝－白筛选33重组基因医学知识讲座第33页（一）平板筛选

是指利用载体遗传性标识在平板上直接筛选方法。含有抗药性标识载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）培养平板上生长；未转化则不能生长。插入失活

当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含对应抗生素培养平板上。34重组基因医学知识讲座第34页

抗生素平板筛选（插入失活）35重组基因医学知识讲座第35页2.蓝-白筛选

利用蓝色化合物形成作为指示剂，筛选带重组质粒细菌。载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互补细菌表示：β-半乳糖苷酶活性↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成蓝色菌落

当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶C端进行α-互补→产生白色菌落。

（IPTG存在下）

36重组基因医学知识讲座第36页

蓝－白筛选示意图37重组基因医学知识讲座第37页(二)限制性内切酶图谱判定38重组基因医学知识讲座第38页（三）PCR筛选重组体

抽提少许重组DNA→PCR扩增→电泳判定→序列分析。（四）原位杂交技术39重组基因医学知识讲座第39页1、获取

DNA重组基本过程(小结)40重组基因医学知识讲座第40页2、重组41重组基因医学知识讲座第41页3、转化体42重组基因医学知识讲座第42页4、筛选43重组基因医学知识讲座第43页5、克隆44重组基因医学知识讲座第44页6、表示表示产物分离纯化45重组基因医学知识讲座第45页五、重组体在宿主细胞中表示和调控

基因工程最终目标是经过载体将外源基因导入适当宿主细胞中高效表示，产生有主要价值蛋白质产品。

克隆基因表示有三个条件

⑴基因编码区不能被插入序列中止;

⑵基因转录要有开启子，而开启子必须能被宿主

细胞RNA聚合酶有效地识别;

⑶mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生外

源蛋白质必须不为宿主细胞蛋白酶所降解。46重组基因医学知识讲座第46页第四节重组技术在医学和制药工业中应用

一、疾病基因发觉

1990年美国科学家率先开启人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至年完成；

年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣告，人类基因组3X109bp最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组全部核苷酸序列很快即将完成。但要揭示人类4万个基因功效任务将更为艰巨。47重组基因医学知识讲座第47页

人类基因组图谱初步完成，不但为全部基因定位建立了一个开放框架，而且为分离、判定人类疾病相关基因提供了参考模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是因为一些基因结构异常或基因位移等突变所致。假如利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有利于说明遗传病分子机制，这对遗传病基因治疗将起到不可估量推进作用。48重组基因医学知识讲座第48页

产品名称治疗功效与医药范围

1.人胰岛素

治疗糖尿病2.人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合

3.α干扰素治疗癌症、病毒感染4.β干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.γ干扰素治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶去除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死

9.凝血因子Ⅷ治疗A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤镇痛13.降钙素治疗骨质疏松症二、生产蛋白质和多肽类活性物质49重组基因医学知识讲座第49页基因工程生产胰岛素原理（示意图）50重组基因医学知识讲座第50页三、制备基因工程疫苗

基因工程疫苗能够帮助处理传统技术难以处理一些特殊病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用疫苗，如人T细胞免疫缺点病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。51重组基因医学知识讲座第51页四、改良物种特征52重组基因医学知识讲座第52页

动物药厂经过转基因动物生产感兴趣基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白开启子下

↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕母羊体内

↓YFG在乳腺中表示

↓乳汁中提纯YFG蛋白。

53重组基因医学知识讲座第53页1.分离体细胞（先处于“饥饿”“静止状态”）→使“关闭”基因全部“打开”。2.植入去核卵细胞中→胚胎细胞3.将胚胎细胞植入寄养母体内。五、动物克隆54重组基因医学知识讲座第54页

六、其它应用（略）55重组基因