重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术

疟原虫检验技术重庆市疾病控制中心地寄所

课件责任人蒋诗国

9月重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第1页血涂片检验疟原虫是诊疗和判定疟原虫种别主要方法，也是疟疾流行病学调查主要部分，血涂片制作和染色好坏足心影响检验结果，必须把握好“三关”。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第2页玻片清洁。清洁玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜轻易脱落，薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只能夹持玻片两侧边缘，不要接触玻片表面，以防止手指上油污染玻片。一、玻片清洁重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第3页新载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净毛巾擦干待用。(一)新载玻片洗涤重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第4页①5%肥皂水煮沸法：

将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。(二)使用过载玻片清洁方法有两种：重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第5页②清洁液浸泡法：清洁液配制以下：重铬酸钾80g浓硫酸100ml水(清净水)1000ml重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第6页配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖大口玻璃缸内。清洁玻片时，将待洗玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第7页二、制片1.薄血膜涂制2.厚血膜涂制薄血膜厚血膜标识处重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第8页1.薄血膜涂制：1.薄血膜涂制(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针快速刺入耳垂近下端边缘处。(2)用左手拇指与食指以及右手中指向相正确方向将耳垂轻轻挤压出血。(3)取一张洁净载玻片，将它左1/3表面接触耳垂上血滴（不要将玻片接触耳垂上皮肤），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3.1/4火柴头大小。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第9页(4)将推片置于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀快速将推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得很好薄血膜只有一层血球，血球分布排列比较均匀，血膜末端突出如舌状。若取血滴太大，则涂制血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状.若用力太大，则血膜两端过厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第10页薄血膜涂好后，再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血滴，将这一滴血滴在玻片中心1/3处然后用推片一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米圆形血膜，旋转涂制时间不宜过短，以免形成纤维蛋白束，遮盖了疟原虫。

厚血薄涂好后，应平放待干，防苍蝇舔食血膜或灰尘落在上面。受检者编号可用铅笔或钢笔写在薄血膜边缘上，也可用蜡笔写在厚血膜一端。2.厚血膜涂制重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第11页血片制作和染色质量规范

项目血膜好中差血片制作

厚血量位置直径外观4.0～5.0mm3玻片右1/38～1.0cm圆形厚膜均匀，边缘整齐略多或略少稍偏右0.7～0.8或1.0～1.2cm圆形稍不均不整齐过多或过少偏右过多＜0.7或＞1.2cm厚薄不匀影响着色薄血量位置长宽外观1.5～2.0mm3玻片1/2～1/3处1.5×2.0cm舌状厚薄均匀略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌状稍不匀过多或过少偏右或偏左过多过大或过小厚薄不匀呈波浪型染色外观镜下兰紫色白细胞疟原虫浆呈兰色，核深红深兰色胞浆淡兰或深兰，核红色红色或灰白色胞浆不易见，核淡红或兰色清洁度外观镜下光洁无油灰无沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘连沉渣多或有杂菌重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第12页血片制作和染色质量判定标准1.血片制作质量判定标准：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第13页2.血片制作和染色合格率要求：分别以血片制作、染色和清洁度好、中、差合并计算合格率。(1)血片制作合格率应在85%以上。(2)染色合格率应在85%以上。(3)清洁度合格率应在80%以上。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第14页三、染色惯用染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种(一)吉氏染色法：吉氏染剂是最可靠血膜染剂，其优点是易于掌握极少染色过分，染好后血膜褪色较慢.

重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第15页吉氏染剂粉0.5g甘油（中性）25ml甲醇（纯，分析纯）25ml将吉氏染剂粉0.5置于乳钵中，加少许甘油充分研磨，再加甘油研磨，直至25ml甘油加完为止。将充分研磨吉氏甘油液倒入无水，洁净棕色玻塞瓶中，然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中，直至25甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中，塞紧，充分摇匀，放置室内一星期，天天摇动数次，以后即可使用.1.吉氏染剂配制：重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第16页为了确保染色良好，使疟原虫红核和兰胞浆分明，感染红血球上薛氏小点清楚，在稀释染剂原液时，所用蒸馏水必须加缓冲液（缓冲蒸馏水）。新鲜蒸馏水可能靠近中性，但贮存在一个时期后，因为吸收了空气中二氧化碳而变为酸性，所以蒸馏水中必须加缓冲液，使其到达我们需要酸碱度。

2.缓冲液配制;重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第17页

磷酸氢二钠（无水）9.5g

蒸馏水1000ml

磷酸二氢钾9.07g

蒸馏水1000ml

将上二液分别贮存于紧塞玻瓶中。

缓冲液配制：重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第18页稀释染剂所用蒸馏水ph以7.0-7.2为最适宜，现用现配，可按下表配制：缓冲蒸馏水配制（ml）

ph磷酸二氢钠液磷酸二氢钾液蒸馏水6.637639006.849519007.063379007.273279007.48119900在无条件地方，此时也可用当地饮用水煮沸过滤后试染，试染结果如淋巴细胞胞浆呈兰色红血球染色不很兰就可使用。

重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第19页3.染色步骤：①固定：用吉氏染液染色须先将薄血膜用甲醇或无水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，防止甲醇流至厚血膜，误将其固定，可用蜡笔划一条线，或者是斜放玻片，玻片上甲醇蒸发干后即可染色。②溶解血红蛋白，在厚血膜上加2-3滴蒸馏水，待血红蛋白充分溶解后倾去玻片上水，待血膜干后即可染色。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第20页③染色：快染：5：1(20%)，5滴水，1滴染液(原液)，染5分钟清水冲洗即成。慢染：20：1(5%)，20滴水，1滴染液(原液)，染30分钟用清水冲洗。待片水干后镜检。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第21页(二)瑞氏染色法：瑞氏染色法优点是操作简便快速，缺点是染液在热环境中易变质，且染色时间不易掌握，血膜上有染剂沉淀；用本法染色血膜退色较快，不宜作长久保留标本。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第22页瑞氏染剂粉0.2g

甘油(中性)3ml(无中性也可)

甲醇(中性)97ml

将瑞氏染粉放入乳钵中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇10ml，混合后倒入干燥、清洁棕色玻璃瓶内，分次将甲醇倒入乳钵内，至乳钵内染剂洗净为止，配制好染液充分摇匀即可使用。1.瑞氏染剂配制重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第23页（1）先用蜡笔在厚薄血膜间划一界限，然后用缓冲蒸留水滴2-3滴在已干厚血膜上，溶血后倾去水滴。

（2）加瑞氏染液5-8滴于薄血膜上，染色1-2分钟。

（3）加5-8滴缓冲蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均匀后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色约10分钟。

（4）用清水轻轻冲去染液，将玻片直立待干后镜检2.染色步骤重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第24页四、镜检(1)间日疟原虫薄血片形态①被寄生红细胞形态改变大小：显著胀大色泽：褪色斑点：红色薛氏小点，细小数目多，重复感染：不多见重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第25页②小滋养体胞浆：淡蓝色，较大，稍粗厚，有一个空泡。核：红色，通常一个，圆形。体积：较大，约占红细胞直径三分之一。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第26页③大滋养体胞浆：阿米巴样，含数个空泡，体积较大，浅蓝色核：一个，呈点状或杆状，疟色素：短杆状，细小，棕黄色重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第27页胞浆：阿米巴样，体积很大，空泡甚小或消失，兰色核：2-10个团块，不规则，疟色素：细杆状，棕黄色，分布不均匀④早期裂殖体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第28页⑤裂殖体裂殖子：12-24个，多为16-18个，排列不规则，疟色素：棕黄色，常集中于一侧。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第29页

形状：圆形，较小胞浆：淡兰色，核：疏松，较大，常位于中央疟色素：棕色，杆状，均匀散在，⑥小配子体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第30页⑦大配子体形状：圆形，较大胞浆：深兰色核：致密，位于一侧疟色素：棕黄色，均匀散在，数很多。重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第31页(2)间日疟厚血片形态①小滋养体胞浆：大多呈“感叹号”，“问号”，飞鸟等形状。核：较大，多数是一个，重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第32页间日疟大滋养体相当大，形状不一，改变很多，胞浆兰色，分散断裂成为大小数目不等、边缘不清楚圆块，这是间日疟原虫大滋养特征，核一个，大而显著，呈不整齐圆形，位于胞浆中央或边缘。疟色素短杆状，棕黄色，分布于胞浆上中。②大滋养体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第33页胞浆多，形态改变很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状疟色素较多。

③裂殖体前期重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第34页重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第35页胞浆多，形态改变很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状疟色素较多。

③裂殖体前期重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第36页裂殖子12-24个不等，色素集中，位于中央或一侧。④成熟裂殖体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第37页间日疟原虫配子体很大，几乎同中性白细胞一样大小，胞浆完整致密呈圆形或椭圆形，雌雄配子体形态与薄片上形态完全相同，配子体有时易与晚期滋养体相混同，但配子体胞浆比较固实，色素颗粒多而分散并有沿边缘分布现象。⑤配子体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第38页间日疟雄配子体间日疟䧳配体子体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第39页1恶性疟原虫薄血膜--环状体环纤细,约为RBC直径1/5核1个，但2个常见红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞边缘，呈“鸟飞状”重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第40页2恶性疟原虫—大滋养体

普通不出现在外周血体小坚固，圆形，不活动疟色素集中一团，黑褐色原虫此时开始集中在内脏毛细血管重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第41页3恶性疟早期裂殖体重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第42页4恶性疟原虫成熟裂殖体

裂殖子8～36个，通常18～24个，排列不规则疟色素集中成一团虫体占红细胞体积2／3至3／4重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第43页5恶性疟原虫雌配子体新月形，两端较尖核致密，深红色，常位于中央疟色素黑褐色，分布于核周围重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第44页5恶性疟原虫雄配子体腊肠形，两端钝圆胞质色蓝而略带红核疏松，淡红色，位于中央疟色素黄棕色，小杆状，在核周围较多

重庆市疾病控制中心疟原虫检验技术第45页恶性疟厚血片形态环状体核1-2个，常呈“!”、飞鸟等形状。大滋养体常呈圆形、疟色素集成1-2个团。裂殖体较小，裂殖子8-26个。䧳配