药品微生物检验特点和过程控制专家讲座

药品微生物检验特点

及过程控制中国药品生物制品检定所马仕洪年5月26日上海website:e-mail:mash@tel/p>

地址：北京市天坛西里2号邮编：100050

1药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第1页药品微生物检验特点及过程控制药品原因环境影响培养观察抽样检验破坏试验方法验证过程控制2中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第2页无菌/微生物程度检验理念环境确保培养基确保无菌性检验灵敏度检验有效方法方法验证SOP操作有效结果可靠结论结果判断3中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第3页微生物检验过程控制一、试验设施（硬件——物质保障）二、检验程序（软件——有效结果）三、结果判断（调查——可靠结论）4中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第4页一、试验设施试验室系统操作环境关键设备对照培养基物质保障5中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第5页（一）、试验室系统洁净试验条件有效性：整体10000级、局部100级。安全性：保护样品、人员和环境。可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净试验条件维护、验证阳性菌试验室到达P2生物安全标准6中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第6页试验室改造示例：原布局图

确定布局图

提议布局图1

提议布局图2

试验室系统——中检所微生物试验室7中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第7页（一）、试验室系统试验室系统管理与维护：1、屏障系统有效性压差、风速、微粒、照度（外包服务协议）2、清洁、静态与动态监控、熏蒸3、环境菌库酒精棉球分离微生物新洁尔灭分离微生物8中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第8页环境菌库洁净环境常见菌（浮游菌）：头状葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）缓症链球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus

luteus）9中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第9页（二）、操作环境1、隔离器2、生物安全柜3、超净工作台10中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第10页（二）、操作环境分类样品安全人员安全环境要求点评隔离器？验证困难，灭菌不彻底：假阳性灭菌剂残留：假阴性生物安全柜？动态验证困难，不适合多任务检验活动超净工作台经典、廉价、适合多任务检验活动。提升试验室新风供给、加强试验室监控能够扬长避短11中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第11页搽拭试验菌株菌液计数回收计数回收率大肠埃希菌191894.7%金黄色葡萄球菌646093.8%菌液稀释、分液误差为：5.5%表面搽拭操作回收率大于99%12中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第12页（三）、关键设备微生物检验薄膜过滤仪一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器13中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第13页（四）、对照培养基培养基适用性（灵敏度）；培养基性能稳定性（标准化）。对照培养基理化评价（可控性）生物学评价（有效性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价一些CRS标准固态培养基液态培养基琼脂加减法14中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第14页二、检验程序环境确保培养基确保无菌性检验灵敏度检验有效方法方法验证SOP操作有效结果可靠结论结果判断15中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第15页二、检验程序接收任务试验方案试验准备样品查对试验操作过程监控培养观察有效结果物质保障16中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第16页试验室管理规范（软件）中检所抗生素室微生物试验室质量管理体系编写说明及同意页1试验室概况1.1试验室介绍1.2试验室通讯资料1.3试验室认可项目/参数表1.4试验室平面图及功效区域1.5仪器设备总览1.6常备试剂耗材一览表1.7试验室发展目标2管理规范2.1安全管理2.2业务流程2.3人员管理（6个SOP）2.4样品管理（3个SOP）3标准操作规程3.1检验工作SOP（13个）3.2仪器操作SOP（30个）3.3试验统计SOP（9个）4试验室保障4.1试验室设施、设备及消耗品供给商确定标准4.2试验室设施服务商4.3试验设备供给商4.4试验室消耗品供给商17中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第17页（一）、试验准备试验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时确保“来之能战”。尤其注意常备使用期要求物品：培养基、冲洗液、滤器、小型试验器材等。18中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第18页试验准备——无菌室专用酒精棉球制备

试验准备——场地清洁

试验准备——台面清洁

19中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第19页（二）、样品查对尽快取得样品，确保样品传递过程中完整性、安全性、有效性；仔细查对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽可能获取非问题样品及同类样品，进行比较试验、比较分析；样品外观检验、完整性检验。20中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第20页样品外观检验——欣弗

样品外观检验——刺五加

样品外观检验——双黄连

样品完整性真空检漏

21中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第21页（三）、试验操作不停完善标准化操作规程（SOP），严格防止试验室污染。试验人员培养基试验器材试验环境检验结果待检样品原料辅料设备环境药品（食品）人员药品食品生产过程中可能污染微生物主要步骤药品食品微生物检验过程中可能污染微生物主要步骤22中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第22页试验操作——物料进场消毒液搽拭物品外表面洁净传递（风淋、紫外照射）双层无菌包装关键区外围试验操作——人员进场一更二更关键操作区试验操作——无菌操作技术23中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第23页（四）、试验过程监控样品监控手指监控沉降菌监控无菌检验框架示意图24中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第24页三、结果判断长菌是否分离判定溯源调查结果汇报可靠结论有效结果物质保障25中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第25页三、结果判断

是不是微生物？是什么微生物？微生物来自哪里？几点思索

参见：《FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌相同性考察》《药学学报》，，42（11）：1189～1194《判断无菌检验阳性结果有效性试验探讨》《药品分析杂志》，，28（05）：66～71

26中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第26页1、长菌是否？浑不浑浊?物理改变、化学改变还是生物改变？一靠经验二靠试验三靠严格程序控制防止干扰27中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第27页是不是微生物？（1）、液体培养基浑浊物理改变？化学改变？生物学改变？（2）、平板上菌落琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层

菌落or药渣？28中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第28页菌落or药渣？经60Coγ射线大剂量照射再检验延长培养时间到7天重新划线培养镜检29中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第29页2、分离判定（1）马上转接2ml该培养物至相同培养基中继续培养；（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80℃保留；（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；（4）假如发觉硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到菌落应深入判定，并逐一保藏。30中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第30页是什么微生物？宏观：生长形态微观：镜检判定：生化判定（API、BD）核酸判定（16sRNA、DNA）……31中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第31页3、溯源调查样品阳性培养物分离菌株检验过程监控菌株环境菌（近期、远期）现场调查搜集菌株判定与相同性分析相结合传统方法与新技术相结合不一样方法交叉验证32中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第32页微生物来自哪里？

相同性分析同源性分析脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR）

33中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第33页SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms图不一样起源阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系34中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第34页TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第35页36中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第36页溯源性分析例1——欣弗事件

图29欣弗培养物图30欣弗培养物分离菌株镜检37中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第37页编号滤筒中形态革兰染色BD判定0206L浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G浑浊，猛烈产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）0104L颗粒状悬浮物，振摇能散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）298L；298G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、阴沟肠杆菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L浑浊（Alcaligenesfaecalis）308G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）309L浑浊（Alcaligenesfaecalis）309G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）304G浑浊G-杆菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）38中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第38页溯源性分析例1——欣弗事件头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）缓症链球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。监测到环境菌株39中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第39页溯源性分析例2编号BD判定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/无菌室4C.urealyticum无菌室5K.kristinae无菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA判定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%双黄连注射液利巴韦林注射液FTIR相同性分析DuPontRiboPrinter基因指纹分析40中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第40页几点思索（1）、怎样才算是同一株菌？

需要深入认识微生物本身微生物变异与保守相对性；分析方法可变性与微生物本身可变性；生物学先锋琳恩·马古利斯(LynnMargulis)曾表示：“假如将一个特殊质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。41中国药品生物制品检定所药品微生物检验特点和过程控制专家讲座第41页几点思索（2）、什么是最适宜技术？

需要深入认识分析微生物技术和伎俩形态学分析与相同性分析（生化反应谱、片段相同性、FTI