基因工程重组人干扰素概述

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

I型干扰素：ＩFNα、IＦNβ、ＩFNτ、IFＮω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长

免疫调节〔较弱)

其中IＦN-α为多基因产物,有２３种以上的亚型。ＩI型干扰素：干扰素γ(ＩFN)来源：活化的Ｔ细胞和NK细胞产生功能：免疫调节提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力增强Tc细胞和ＮK细胞的杀伤活性抑制TH２细胞形成,下调体液免疫应答趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用〔次要)２.根据动物来源确定分类,例如人干扰素〔HｕIFN)，小鼠干扰素(MuＩFN)。免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响,如对巨噬细胞、T细胞、Ｂ细胞和NK细胞等均有一定作用。对巨噬细胞的作用：IＦＮγ可使巨噬细胞外表ＭHCⅡ类分子的表达增加,增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD８+T细胞的分化有促进作用,但不能促进其增殖。ＩＦNγ能增强ＴH１细胞的活性,增强细胞免疫功能；但对TH２细胞的增殖有抑制作用,因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH２细胞产生IL－４,而且抑制IL-４对Ｂ细胞的作用,特别是抑制B细胞生成IgＥ。对其它细胞的作用：IFＮγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞,增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MＨCⅡ类分子的细胞〔如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHCⅡ类分子,发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉,吸引循环的淋巴细胞。二重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性(rｈuＩFNα〕慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性(rｈｕIＦNα〕毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔ｒhuIＦNγ)多发性硬化症rhuＩFNβ对基因序列的干扰素,基因文库的调用可以用其序列３＇端和５'端局部事先用同位素ﻫ标记过的序列作为探针，通过杂交的方法进展调用。由于干扰素基因的种属特异性不是很大,|可以用人的干扰素基因为同源探针,从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因,其方法将在下文１中提到。｜

对于扰素基因的取用,不仅可以使用构建基因文库的方法，对已了解其氨基酸或核昔酸割

成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的DNA序列,再对其进展表达。化学合｜成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利用基因文库的方法相比,化学合成法比较|复杂，由于每参加一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况,并且在ｌ整个合成过程中这种错误不断积累，因此该方法适合比较短的基因,而对长的基因那么有目的产|物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点,如可根据研究的需要对一些氨基酸进展定点|突变,或根据宿主菌的特性，在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子,以提高|产物的产量。|ﻫ对于不同亚型的干扰素,由于同源性较高,可以用一样的引物从诱导的小鼠细胞系中提取ﻫmＲＮA混合物进展反转录和扩增,然后用亚型特异性探针对CDNA混合物进展Ｓoutheｒn印迹,这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因进展别离,为生产高纯度的单一干扰素提供了方法Ｏﻫ三、表达方法ﻫ随着对干扰素研究的深入,人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的

１０～４０位、７８～１０７位、１２３～１６６位的Ａ、B、C区，尤其是位于７８和７９位的氨基酸对抗病毒|活性十分重要。而人IFNt１的１２１～１３６位对抗病毒活性作用较大,人ＩFＮ子的N端１０个集|基酸也是保持其活性所必需的。对干扰素构造的了解为更好地构建基因表达奠定了根底。干|扰素最初是用其外源序列进展表达的，但近年来的研究说明嵌合表达的干扰素往往优于单一

干扰素,因此出现了较多的嵌合表达形式,并取得了较好的效果。ﻫ１.ＩFN-α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点,同时由于家蚕为真核生物,能对表达产物自行进展糖基化修饰,产生有生物活性的蛋白，并且在产物提取的过程中只要将家蚕进展匀浆,再进展抽提即可，操作上十分方便，因此,它在基因工程领域内被广泛应用。下面便以人IＦN,α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。

用家蚕核型多角病毒BIIＩNPV体外感染的家蚕传代细胞株BＭ-N通过噬菌斑法纯化得到BmNPＶ的τ３亚型。利用从感染脂肪体mRＮＡ制得的CDＮA为探针，对其多角蛋白序列进展检验，其中１０．５ｋb的EcｏRＩ片段及３.９灿的ＨｉndE片段可与探针杂交,将１０.５灿的EcｏRI片段克隆到pＢR３２２中,产生质粒pBｍE３６０对其用HｉndＥ切，得到３.９ｋb片段，其中|含有多角蛋白全部序列(图１２３中为黑色框架),将该片段插入pＵC９的HinｄE位点,产生质|粒p９H１８。将ｐ９H１８用EｃｏＲI切后于５０UＢAＬ３１外切核酸酶缓冲液中２３℃水浴１０miｎ,更|掐锺油油菲如ｎ入０７倍他烈的。气mｎlAｄEDＴA终止反响。将截短的p９H１８片段用HindEi切,并通过琼脂糖凝胶电泳别离２.７kｂ的Hｉnd皿平头末端片段,将其插入pUC９即ｐ９B３１０ﻫ的HiｎｄHＩ-ＳｍaＩ位点O另外,将pBmE３６的３.１峙的HinｄE片段连接到ｐＵC８上，得到质粒ｐ８H２２５，用EcｏRI及AatＥ切,得含有多角蛋白基因下游３.１kb基因的３．５kb片段,将其连接到p９H１８的４.７kb的ＥcoRIAaｔE片段上，产生杂交质粒ｐ８９B３１０,它在启动子下游含有多聚接头〔EcｏＲI、BaｍＨＩＳｍaI、SalＩ、ＰstI位点〕。将从基因文库中用１８３bp探针调出的在AＴG后含有SmaＩ位点〔即有序列ＣＣCＧＧGATＧ)的IFNｍαＪ基因片段连接到p８９B３１０上，便构建成质粒pIＦN２Ｂ３１０。将pＩFＮ２B３１０与病毒基因组DNＡ便可共转染ＢM-N细胞系或家蚕幼体,其具体操作如下：向２．５mＬ含有０.２５mｏlACaＣl２、１０μgＢｍＮPVＤNA及６５μｇｐIFN２Ｂ３１０的溶液中加含０.２８II１０１４NaCl、０．７mｍoi/ＬＮａ２C０３、０．７IIIＩI１０１４Na２HP０４、５０mｍol/LEfＥPＥ(pH７.１〕的缓冲液，进展沉淀。取０.４５mｌ沉淀加至４.５ｍi含３×１０６个细胞的培养液中,１２ｈ后换液一次，再培养４d,即可得到重组病毒ＢmIＦN２Ｂ３１０。用ﻫ两个噬菌斑单位的病毒感染３×１０６个BM－N细胞或用５０μＬ３×１０５个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体,培养２４h后收集培养液便可得到干扰素。ﻫ２.IFN-目的表达将人IＦN-R基因HiｍdＥ片段插人载体ｐSV２-dｈfr中SＶ４０晚期启动子PL下游的PｖuE位点。用此重组质粒与带有黄瞟岭磷酸核糖转移酶(XGＰRＴ)基因的质粒pSU－-gｐt共转染次黄瞟岭磷酸核糖转移酶〔HGＰRＴ)基因缺陷小鼠的骨髓瘤(sp２４)细胞Ｏ经过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选，便可得到表达人IFN-R。具体操作步骤如下：将含有人IFN-ﻫp基因的重组质粒ｐBV－９２用EcoRI及HｉndE酶切,分别作为探针模板及插入片段，同时用PvuII切载体pSVZdhfｒ质粒,使其线性化后将外源基因插入。将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的sｐ２／０细胞在含有１０％小牛血清、１０%青链霉素的ＤLｆEM培养基中传３～４代后在小空斑瓶中培养２４h,成半悬浮状，４００r/勺１in离心５mｉn将细胞沉积参加新鲜培养基,再培养２～４h。转染液中含目的基因pSVHIＦ和标记基因pＳVZgpt(比值为１０：１),其中ＤNA浓度为２０μg/IＩIｌo在２ＩIIol/LCaCl２６３阵、１０mmolAＴｒis－HＣl(pH７．１)４２８μＬ中缓缓参加２×HeBs液(EEPES５０ｍmol只L、NaCl２８０ｍmｏlA、Na２ＨP０４０．７５mmolA、０．７５IIlII１０１４Na２ＨP０４,pH７.１)约５００μＬ,参加sｐ２/０细胞培养物中,轻轻摇匀３７℃孵育８h。再更换为含有黄瞟岭２５０μg/mＬ、次黄瞟岭１５μg/ｍL、胸昔１０μｇ/mL、氨基蝶岭。－２μg／mＬ、霉盼酸２５问／mL的ＤｈEM培养基，３７℃cq孵箱中选择性培养。一周后更换为含２５０μg/mL黄瞟岭的D；旧M培养基，继续培养２周以上,检查IＦＮ－P活性。

３.ＩFN－γ的表达以鼠干扰素ＭｕＩFＮ-γ为例(图１２-３)。用含人IＦN-γ编码区基因的探针与噬菌体γMG９构建的鼠Ｍ６００基因组DＮA文库在２０%甲酷胶中进展低严格性的杂交，膜用０．３molANaＣl、０．０３II１０１４拧棱酸纳及０.１％NaEbS０４在室温洗涤两次。将结合的噬

菌体用噬菌斑法纯化,提取DNA后,用多种限制性内切酶切,以１%葡聚糖凝胶电泳纯化后与人ＣDNＡ探针杂交,将γMG９中与探针可以杂交的１０.５kb的BaｍHI片段亚克隆到pＢR３２２的BaIIＩＨI位点,产生质粒pMＧ１０.５。通过电泳分出插入片段大于６０００坤,即含有完整MuＩＦN-Y的质粒,用PｖｕＩI酶切,六个切点中有一个位于５＇端非编码区,取从此切点到第一内元中ClａI的３４８bp的片段以及用ClaI及BglH酶切得的ＭuＩFNmγ３F端片段Ｏ将载体质粒ｐ３４２E用EcｏＲＩ及BamＨI酶切，并用聚合酶Ｉ将ＥcｏRI切点补成平头末端,与以上制得的两个片段混合，一同转化大肠杆菌２９４,选出ＡＩIIP抗性菌株,从中提取质粒即为含有干扰素编码基因的ｐSＶEＩＩ１１１γ。用外表活性剂右旋糖所活化COEL１细胞,将质粒转入并培养４８ｈ后离心，上清液中便含有干扰素。

４．嵌合干扰素的表达嵌合干扰素大致可以分为两种类型：一种是两种不同类型或同类型而不同亚型的干扰素间进展嵌合,另一种是干扰素或其局部序列与其他活性物质,如抗体、白介素等进展嵌合,以便得到新的生物活性产物。下面就这两种情况分别举例介绍。ﻫ将从基因文库中调出的编码淋巴细胞干扰素B和D的CDNA连接到大肠杆菌色氨酸启动子、操纵子、核糖体结合位点及起始密码子ATＧ后面,分别构成表达载体pLＹＥN－B和ＰＬy-IFN－Ｄ。为构建嵌合干扰素,可先将亲代干扰素的编码序列在一样位点Ｓ１(Sａ１１３AI)、Ｐv〔PVU

Ｅ)、Ｓ２(Sa１１３AI)切断,产生含有氨基端１～６０、１～９２、６１～９２、９３～１５０、９３～１６６、１５１～１６６位氨基酸的片段,用６%的聚丙烯酿胶凝胶电泳别离(图１２４)。将适宜的片段连接，得到嵌合ﻫDNA,将含有嵌合ＤＮA的质粒用ＨindE和PsｔＩ切后将酶切片段连接到pＢR３２２的ＨｉｎdＥmpsｔI位点上,将得到的表达载体转入大肠杆菌中,同时对DNA序列进展测定。含有转入质粒的大肠杆菌HT－２在M９培养基中培养到OD６５０为５～８时,离心得到细胞,并用含１００mｍｏIA

Ｔris－ＨＣ１、０.５ｍolＡＮaＣｌ、５mmｏlAEDTA及０．１ＩIIEｎoｌ/LPMSF的pH为８．０的缓冲液重新溶解之。在０℃参加１mg/ｍl溶菌酶,细胞在溶菌液中裂解。离心后将上清用单克隆抗体亲和层析柱纯化两次,将纯化后的活性干扰素溶于ＰBS后利用超滤膜ＹM１０浓缩至１～３时,再将浓度调整到０.１／ﻫIIIgｍlo利用SDS聚丙烯酷胶电泳对于扰素的纯度进展测定。

IFN-γ及ＴNＦ-R基因已经分别被克隆,并用工程菌加以表达。对其序列的研究说明，IFN-R在竣基端的１３个氨基酸以及TＮF-下在氨基端的２３个氨基酸均对它们的生物活性没有影响,因此在设计构建ＩFN-γ与TNER嵌合物时可以将其去除,利用色氨酸启动子构建的含有IFＮEγ氨基端１３４个氨基酸及TNF-Ｐ竣基端１４８个氨基酸的表达质粒构造见图１２-５０

此外，基因工程在抗体技术上的应用使干扰素与抗体能够有机地结合,通过抗体的靶向作ﻫ用,增强干扰素的定向能力，提高干扰素体内作用的效率。

５．提高干扰素产量的方法干扰素是一种诱生物质,必须在一定的诱生剂如病毒、细菌等作用不才能生成,所以在基因工程中,常常用一些强启动子如色氨酸启动子，将干扰素的表达从条件型变为组成型,以提高产量。

酵母是一种较为常用的表达宿主，但其外源基因的大量表达必须在缺少元机磷的条件下才能进展。通过对其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及温度敏感型负调控基因进展改造,就可以使酵母菌在３５℃的高温下生长,在２５℃下诱导表达,并且其表达与无机磷的含量无关。实验说明未诱导时产量为６×１０４UA,而诱导后产量可到达１×１０７UA。ﻫ由于ＩFＮ-α、自、γ性质各异,在进展表达时，ＩFN干的产量往往远不及IFN-α、ＩFN-日，因此就必须进展表达体系的改进。如利用含噬菌体T５早期启动子及强核糖体结合位点的高效转录二表达体系,可以使IFN－γ的表达也到达４×１０９U／L的水平。其方法为用人工合成的T５P２５强启动手｛其中含有启动于及核糖体结合位点)：取代质粒pJP１在EcoＲV与HｉnｄＥ之间的Tｅf启动子,形成质粒pＪR１Ｒ３,将其用ＨindE线性化后插入ＩFＮEＹ的编码序列,便可以得到高效的表达质粒IFNγ－IFNY。将IFN基因置于Teｔr基因的上游,有利于转化质粒的筛选和保持〔图１２-６)Oﻫ其中合成的启动区序列为：

E∞RI３５区－１０区ﻫGAAIＴCＡAAAATrrAτTＴGＣＴTτ℃AＧGAＡＡAＡＴTTＴI℃IGTAＴAＡTﻫE丑nd皿ﻫAGＡIτ℃ATAAATTTGAAGCTAＧＧAGGＴＴTAＡGCTTﻫ启动子核糖体结合位点四、提取、纯化及鉴定对干扰素的提纯可分为粗提和进一步纯化，以IFN-α为例,粗提时将菌液５０００r/min离心取细胞,参加１／１００体积的７ｍｏl/L盐酸肌冰浴２ｈ裂解细胞后１７０００r/ｍin离心５min，取上清液。用５～１０倍体积的０．１５mol/L棚酸盐缓冲液稀释后在１OＩIIII１０１４的NＨ４Ci中透析２０ｈ,再１５０００r／min离心１０ｒＩlino将上清液用８０%(ＮH４〕２S０４

沉淀,用水溶解后再透析去除(NH４)２S０４,再用离子交换的方式别离各种蛋白O如果要进一步纯化,可用单克隆抗体进展亲和层析。将Sepｈarose４Ｂ与纯化的抗IFN-α单克隆抗体混合振摇，室温放置４ｈ后低速离心，并用０.１Eｎoｌ/L=Ｎ注fC０３(ｐH８.５)的缓冲液洗去未结合的抗体,参加等体、积的乙醇胶并振荡４h以上,将残存的活性基团加以封闭O：用ｐH４.０的醋酸盐缓冲液及ｐH８.０的Tｒｉｓ－HCｌ缓冲液交ｉﻫ替洗涤３次,并用pＨ７.５的０.１molＡTrｉSEHCｉ加以平衡１后装柱。用ｐH７.２的０.０１molJLPＢＳ洗柱至洗脱液‘OＩh８０到基线，将含有IFN的混合液上样,如一次吸附不完A全可用流出液再上柱一次。用PＢS反复洗柱，至流出液的１吸收回到基线。用pH２．５的０.１mｏlAGly－ＨCl洗脱并分４段收集,并对各局部浓度进展测定。最后用ｐH２．５的０.１ｍolＡGｌｙ-ＨCｌ再生,用含０．０１%间的PBS冲洗净,４℃保存。同时,利用亲和层析技术还可以对只占总蛋白０.１％～１%的干扰素进展别离和浓缩。

五、活性检测

１.对(３二５')ｏligo(A)合成酶活性的诱导在含１％小牛血清ﻫ的RPMＩ１６４０培养基中培养２×１０５个／mlDaｕｄi细胞,并分别参加１U/m１、１０Ｕ/ｍl、１００U/ｍl、１０００Ｕ/mlＩFN。２４h后９０００r/ｍiｎ离心２min,并将沉淀分散于５００μL冷的含２０mmoiAEｆEP－ES、５mmｏl／ＬMgCl２、I２０ｍmol只LKCl、７mm０１４二硫苏糖醇、１０%甘氨酸、０５%ＮＰ４０(pH７.５)的裂解液中,冰浴２miｎ后９OOＯr/ｍｉn离心８IIlino取上清与５０μＬｐoly(rI)：ｐｏly〔rC〕琼脂在３０℃共浴１５min,离心去除未吸附局部，而将结合物与２．５mmolA[α－３２p］－ATP及磷酸激酶在３０℃水浴２０h。将混合物上３０μL酸性矶土柱,用３ｍllｍolA盐酸肌洗脱,将洗脱液与未用IFN诱导的对照组进展比较便可测出IＦN的活性。

２．抗增生活性在含１５%小牛血清的RPMI１６４０培养基中培养５×１０４个／ｍlDａｕｄa细胞，４８h后参加IFＮ，再培养７２h,用２BI型库尔特计数器对细胞进展计数，即可以得到IＦN的抗增生活性。

３.细胞病变抑制作用将在含１０%小牛血清的DMEM培养液中培养的ＷISH细胞用０.０３%ＥDＴＡ、０.２５%的膜蛋白酶１mi在室温下消化２～３min后,倒出消化液,用Eａgle液分散细胞,然后用含１０％小牛血清的DMEM液配成５×１０５个/mｌ的细胞悬液，用微量板在

３７℃含５%C马的培养箱内培养过夜。用不同稀释度的０.１mlＩＦN溶液参加各孔后再培养７h。每孔参加０.１ｍl含１００～１０００ＴｃID５０滤过性口腔炎病毒(VＳV〕进展病毒攻击。将病毒对照组与细胞对照组进展比较便可以测得其抗病毒活性。ﻫ六、新型干扰素

１．活性增加的干扰素通过定点突变或干扰素的嵌合可提高干扰素的活性,如将重组干

扰素自１７位的Cys改为Ser,可提高抗病毒活性１０倍。新型杂合的IFN-αD对NＫ细胞的调节能力比亲本提高了１０～４００倍,如将IＦN－α４与IＦＮtｌ进展嵌合,得到的IＦN活性分别是亲代的４倍及２０倍。而用鼠ＩFNｔ１的A段与IFN-饨的Ｂ段进展杂交,活性可提高１０～１００倍。此外,如上面介绍的将IＦN与TNＦ结合,可以产生不同的活性。

２．稳定性增加的干扰素仍以上面提到的重组ＩＦＮR为例,亲代干扰素在一７０℃７５d后

大多数丧失抗病毒活性,而突变后在同样条件下保存１５０d仍不失活。

３.改变抗原性的干扰素如将IFN仇的１４１位上Cys用Ｔｙr代替，那么其抗原性发生改变,不与体内自然存在的IFＮ在１争夺受体，虽然这种抗原性改变的机率很小，但仍不失为一种研究方向。ﻫ４．改变种属特异性的干扰素IＦN－αＤ在牛细胞株中活性最高,IFN-αA在人细胞系中活

性最高,而其嵌合体与两个亲本都不一样,在鼠细胞中的活性最高。第三节应用一、临床治疗方面ﻫ干扰素作为较早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物质,虽然在基因的调取、构建、表达方面仍有较多的工作在进展中,但研究的热点已经转移到了临床应用及临床前的动物实验方面，并且在较多疾病的治疗方面取得了进展。

１.抗病毒目前的研究主要集中于抗各类肝炎病毒方面,在抗HＩV、抗HSV等方面也有ﻫ较多的研究。

２.提高免疫系统机能在小鼠实验中重组ＩFN－γ对NK细胞的活性、吞噬细胞的溶解性、丝裂原诱导的母细胞化均有促进作用,同时减少外周血及骨髓量。在牛体