细胞生物学研究方法专题讲座讲解材料

细胞生物学研究方法专题讲座讲解材料第1页/共105页本章内容提要细胞生物学研究方法多种多样,总的说来,可分为四个大类:显微技术细胞组分分析与原位检测技术细胞培养与细胞工程分子生物学技术第2页/共105页第一节细胞形态结构的观察方法显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同可分为:光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源第3页/共105页显微镜的发明打开了微观世界的大门光学显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜第4页/共105页第5页/共105页—、光学显微技术普通复式光学显微镜荧光显微镜激光共聚焦扫描显微镜暗视野显微镜相差和微分干涉显微镜倒置显微镜第6页/共105页

1.显微镜的发明300多年前

Leeuwenhoek

世界上最早的显微镜

RobertHooke软木蜂窝状的小格子“细胞”（一）普通光学显微镜

Lightmicroscopy第7页/共105页第8页/共105页第9页/共105页2.光学显微镜构成：①照明系统:

②光学放大系统:③机械装置:镜座.镜柱等目镜与物镜(玻璃透镜)光学显微镜光源、折光镜、聚光镜第10页/共105页经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。第11页/共105页4.分辨力：

D=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsin(α/2)，为镜口率,n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。指分辨物体最小间隔的能力.是显微镜的最重要参数.如何提高显微镜的分辨能力？显微镜的物像是否清楚主要决定了哪些因素？第12页/共105页

增加分辨率的二个必备条件:

增大镜口率---有一定限度缩短波长---为可靠办法普通光镜的最大分辨率为0.2μm,大于0.2μm的结构为显微结构,而小于0.2μm的称为亚显微结构.第13页/共105页

几种介质的折射率为什么使用油镜能提高分辨率?第14页/共105页不同光线的波长第15页/共105页光学显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此光学显微镜的最大设计倍数为1000X。第16页/共105页.普通光镜样品的制作:取材－固定－脱水－包埋－切片－脱蜡－复水－染色－脱水－透明－封片－观察固定剂(甲醛)固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成份；包埋剂(石蜡)包埋;切片(5μm)；染色:如苏木精对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红可使细胞质染色；苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。第17页/共105页紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)什么是荧光?特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜(0.1μm)；有两个特殊的滤光片；可观察活细胞.物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。第18页/共105页第19页/共105页荧光显微镜的光通路第20页/共105页荧光显微镜的特殊用途:用于观察能激发出荧光的结构免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断细胞与组织中物质的吸收与运输化学物质的分布与定位等荧光现象有两种:自发荧光（叶绿素）诱发荧光（加荧光素）第21页/共105页

微管呈绿色、微丝红色、核蓝色Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen第22页/共105页物镜与聚光镜同时聚焦到同一个小点。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重构成三维图像。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像,研究亚细胞结构与组分。共聚焦?第23页/共105页第24页/共105页laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)第25页/共105页第26页/共105页（四）暗视野显微镜

darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。用以观察未经染色的活体或胶体粒子第27页/共105页暗视野显微镜光路第28页/共105页把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的特殊之处:物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ.光源聚光器中增加一环形光阑。由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。第29页/共105页原理第30页/共105页用途：观察未经染色的标本和活细胞。

第31页/共105页（六）微分干涉显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品后两束光再会合，从而样品中厚度上的微小差异就转化成明暗区别，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。观察培养的活细胞。

DIC显微镜下的硅藻第32页/共105页第33页/共105页第34页/共105页倒置显微镜正置显微镜第35页/共105页（八）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。第36页/共105页(九)荧光共振能量转移技术

荧光能量共振转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。第37页/共105页什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。任何荧光物质都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱第38页/共105页39其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。

分子内的光物理过程

第39页/共105页保持固有的荧光特性荧光波长＞激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光的性质第40页/共105页荧光能量共振转移的原理I.荧光能量共振转移:

受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。供体荧光素受体荧光素1.供体与受体间的距离

<10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠II.荧光能量共振转移的条件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)第41页/共105页

荧光能量共振转移的结果：使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。第42页/共105页(十)荧光漂白恢复技术

fluorescencephotobleachingrecovery,FPR荧光漂白后的恢复技术是将待测细胞用荧光物质标记，借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，可以造成该区域荧光分子的光淬灭；通过低强度激光扫描成像，可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率。由于光淬灭过程是不可逆的，荧光恢复过程可明显的反映荧光标记物质及其结合物的运动。第43页/共105页光脱色荧光恢复技术检测膜流动性第44页/共105页二、电子显微技术1932年，德国Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）。目前TEM的分辨力可达0.2nm。通过电子束穿透样品成像第45页/共105页透射电子显微镜(伪彩色)第46页/共105页以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，小于0.1nm.由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。1.原理第47页/共105页电子显微镜与光学显微镜的基本区别

分辨本领光源透镜真空成像原理光学200nm可见光玻璃不要求样品吸收光形成明暗显微镜(400nm-700nm)反差和颜色变化

100nm紫外光玻璃不要求

(约200nm)电子0.1nm电子束电磁要求样品对电子的散射显微镜(0.01~0.9nm)和透射形成明暗反差

第48页/共105页光镜与电子显微镜(透射电镜)的结构第49页/共105页电镜制样要求:样品很薄;样品的精细结构保持完好1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。第50页/共105页莱卡超薄切片机

第51页/共105页电镜样品的制备过程第52页/共105页2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedActin第53页/共105页3）冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。AYeastCell第54页/共105页冰冻蚀刻技术第55页/共105页通过电视成像20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为:0.2mm/10nm=20000X。（二）扫描电子显微镜

scanningelectronmicroscope，SEM

第56页/共105页扫描电镜及其图像人类红细胞第57页/共105页工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。电视的方式成像

扫描电镜的光学系统第58页/共105页扫描电子显微镜原理第59页/共105页透射电镜第60页/共105页人类红细胞yeastMansperm第61页/共105页（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。什么是隧道电流?低电压下,当两电极之间近到一定距离(100nm以内)时,电极之间所产生的电流.第62页/共105页扫描隧道显微镜原理Csatoms(red)ontheGaAssurface(blue).第63页/共105页扫描隧道显微镜成像第64页/共105页STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu第65页/共105页三、显微操作技术

micromanipulationtechnique在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。第66页/共105页显微操作仪第67页/共105页第68页/共105页第二节细胞分离技术第69页/共105页一、离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。第70页/共105页（一）差速离心Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。第71页/共105页LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation第72页/共105页（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）pH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。第73页/共105页CsCl密度梯度离心分离DNA第74页/共105页密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体第75页/共105页1、速度沉降velocitysedimentation

用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。第76页/共105页2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。第77页/共105页Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation第78页/共105页二、流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。第79页/共105页当代最先进的细胞定量分析技术第80页/共105页第81页/共105页三、细胞电泳原理：在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。第82页/共105页第三节细胞组分的分析方法一、细胞内大分子物质的显示方法第83页/共105页组织化学和细胞化学染色方法（histochemicalandcytochemicalstainingmethod）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。（一）固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。第84页/共105页（二）显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺反应：过氧化氢酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。6.多糖类：PAS反应－－黄色第85页/共105页Feulgen反应第86页/共105页二、特异蛋白抗原的定位与定性1.免疫荧光技术2.免疫电镜技术3.免疫印迹技术4.放射免疫沉淀技术第87页/共105页

1.免疫荧光技术根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。第88页/共105页抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图第89页/共105页间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光第90页/共105页补体抗体标记抗补体抗体光源荧光补体结合法原理示意图第91页/共105页第92页/共105页

2.免疫电镜技术:免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术第93页/共105页三、显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。第94页/共105页四、放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。第95页/共105页放射自显影术第96页/共105页五、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成