染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀第1页，共21页，2023年，2月20日，星期六ApplicationsofChIP,ChIP-Chip,andChIP-SeqTargetGeneIdentification(individualandglobal)BindingSiteConsensusIdentificationRNA--DNA--ProteinInteractionsAnalysisofEpigeneticPhenomenon(eg,methylation,silencing)第2页，共21页，2023年，2月20日，星期六StartingChIPTreatcellswithformaldehyde:protein-proteinandprotein-DNAcross-linksstoptranscriptionfactorsintheirtracks(DAY0)Cross-linkingcanbedoneon:SuspensioncellsAdherentCellsTissuesAnatomicalstructuresSeeprotocolandwebpageforadditionalinformationoncross-linkingandexampleprotocols第3页，共21页，2023年，2月20日，星期六FormaldehydeCrosslinkingProtein-ProteinDNA-DNAOtherOptions第4页，共21页，2023年，2月20日，星期六DouncingDouncecontainstwosizesAislargeclearanceBissmallclearanceForceofmovingrodBindounceresults:dispersescellclumps“pokes”holesinmembranebreakscellmembranetoreleasenucleiChIP--Day1SwellingBufferisusedtobloatcelltoallowcellmembranetobreakmoreeasilyduringDouncing第5页，共21页，2023年，2月20日，星期六SonicationusingtheBioRuptor!IncreasesreproducibilitybetweensamplesDecreasescontaminationEasy第6页，共21页，2023年，2月20日，星期六

SonicationCheckSonicationresultsinmanydifferentsizedfragmentsandshouldbeverifiedforyourexperiment6pulses11pulses21pulses31pulses500bp10kbp3kbpFragmentsizelimitsforQiaquickPCRPurificationColumnis100bp-10kb.100bp第7页，共21页，2023年，2月20日，星期六Immunoprecipitation(DAY1&2)

AntibodiesareYshapedmoleculeswithbindingsitesforspecificantigens.Theheavychaincancomeinseveraldifferentclasses.HundredsofAbstotranscriptionfactorsarecommerciallyavailable第8页，共21页，2023年，2月20日，星期六FiveClassesofAntibodiesIgAabout15%oftotalantibodycount.IgMmakesup10%ofourtotalantibodies.IgDlessthan1%IgElessthan1%IgGapprox.75%ofourserumIgpool,mostpolyclonalsandmAbs.第9页，共21页，2023年，2月20日，星期六AntibodyValidationStep1:ShowreactivityonaWestern(denaturedepitope).Step2:ShowIPability.PerformIP,runWesternandre-probewithsameAb(IP-Western)Step3:Roughquantification,truebandshouldbe>50%ofcombinedsignalfromotherbands(ENCODEguidelines)第10页，共21页，2023年，2月20日，星期六PositiveandNegativeAbsPositive1ºAb=anti-wheatgermRNAPolII;murineMAb(DAY1)2ºAb=RabbitAnti-MouseIgG(DAY2)Negative1ºAb=IgGpoolfromrabbitserum(nonspecific,cheap)(DAY1)Additionof2ºAbtomatchthesamples(antimouseisnon-reactivetorabbitIgG),someprotocolswillomit(DAY2)StaphAbindsmoreefficientlytoRabbitIgG第11页，共21页，2023年，2月20日，星期六WorkshopAntibodiesandDNAPositiveControl:mouseanti-PolIIprimarywithrabbitanti-mouseIgGsecondaryNegativeControl:NonspecificRabbitIgGwithrabbitanti-mouseIgGsecondaryThesupernatantfromtheNegativeControlwillbeusedas“Input”later!1°2°2°2°第12页，共21页，2023年，2月20日，星期六Staphylococcus

aureusbinding

(DAY2)WashesProteinAprotectsStaphAfromhostdefenses第13页，共21页，2023年，2月20日，星期六ElutionandCrosslinkReversalAdditionofNaHCO3causesantibodiestoreleasetranscriptionfactors(DAY2)0.2MNaClat67ºfor3hoursormorereversescrosslinks,DNAfragmentsnowfreeinsolution(DAY2)RNaseAisaddeddigestRNAinsample(DAY3)QiaquickPCRPurificationkitisusedtopurifyDNAforPCR,comparingpositiveAb,negativeAb,andInput(DAY3)第14页，共21页，2023年，2月20日，星期六PCRtoVerifyChIP(DAY3)PolIIPrimersDHFR3’UTRPrimersVerifythat:1)ChIPofinterest(PolIIforus)isgreaterfortargetpromotercomparedtoInputvs.negativecontrolcomparedtoInput2)PositiveAbChIP(polII)ismuchhigherthannegativeAbChIP(IgG)fortargetpromotercomparedtonegativecontrolRememberthatifyouaredoingChIPonChip,youwillbeusingthepositiveAbChIPsamplesandtheInputaslabeledtargets,NOTthenegativeChIP(IgG)Lane

Sample1. MW2. 1ulpolIIChIP3. 1ulIgGChIP4. 1ul0.004%Input5. 1ul0.02%Input6. 1ul0.2%Input7. 1ulpolIIChIP8. 1ulIgGChIP9. 1ul0.004%Input10. 1ul0.02%Input 1ul0.2%Input12. MW第15页，共21页，2023年，2月20日，星期六SonicatedChromatin100ul(eg)100%InputNoAb(orIgGsupernatant)10ulInput+90ulBuffer=10%Input

+AbIP’ed,washed,elutedReversecrosslinksQIAquickpurifyElutein50ulEBSonicatedChromatin100ul(eg)100%Input10%Input/50ul=0.2%Input/ulPositiveAbChIPsamplePCR(positivecontrol)1ul0.2%1ul1:100.02%1ul1:500.004%1ul1ul=0.02%50ul=1%ofInputAimfor0.2-2%EfficiencyofChIP第16页，共21页，2023年，2月20日，星期六WGAChIPInputLabelw/CyDyesApplytomicroarrayCompareRed/GreensignalintensitiestoidentifybindingsitesPeakFindingachallenge,butcommercialsoftwareandlocaltoolsbecomingmoreavailableChIP-chip第17页，共21页，2023年，2月20日，星期六ChIP-Seq第18页，共21页，2023年，2月20日，星期六WholeGenomeAmplificationPrincipleofprocedurechIPsamplesstarthereMethodComparisonInput[DNA]Gelanalysisofproducts第19页，共21页，2023年，2月20日，星期六Acknowledgements

FarnhamlabProtocolDevelopmentShallyXuSharonSquazzoCells&MaterialsAlinaRabinovichShallyXuWGADataHennyO’Geen第20页，共21页，2023年，2月20日，星期六100ulSonicatedChromatin1,000,000promotersNoAb(orIgGsupernatant)10ulInput+90ulBuffer=100,000promoters

+AbIP’ed,washed,elutedReversecrosslinksQIAquickpurifyElutein50ulEB100ulSonicatedChromatin1,000,000promoters100,000pro