脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座专家讲座

斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。器材准备脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第1页染色瓶6组，染色架8个。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第2页医学微生物学试验

综合性试验一脓汁和粪便标本中病原菌检测（四）斜面培养物观察革兰染色法肉汤接种法显微镜油镜使用脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第3页斜面培养物观察从普通平板上挑取黄色或白色菌落接种斜面，菌苔颜色，还是原来菌落颜色，黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取紫黑色或粉红色菌落接种斜面，菌苔已经没有原来菌落颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。为了讲解方便，以后试验，依然沿用首次分离得到菌落颜色—紫黑或粉红。从斜面上取菌时，普通只取半个小菌落大小菌量；接种环或接种针在培养基表面轻刮一下即可。

脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第4页细菌染色法单染色法：只用一个染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能判别细菌。复染色法（判别染色）：采取两种以上不一样染料进行先后染色，可将细菌染成不一样颜色，方便判别细菌。抗酸染色:用于检验结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第5页结核分枝杆菌抗酸染色麻风分枝杆菌抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜Hiss染色破伤风梭菌芽胞芽胞染色变形杆菌鞭毛Leifson染色

白喉棒状杆菌异染颗粒Albert染色脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第6页革兰染色法GramStaining革兰染色法是丹麦内科医生ChristainGram于1884年创建一个细菌染色方法，已经有120多年历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典染色法。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第7页革兰染色法原理三种学说通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内结晶紫—碘复合物轻易被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，普通染色时染液酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带负电荷比阴性菌多，所以与带正电荷结晶紫染料结合牢靠，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成份，普通认为是核糖核酸镁盐与多糖复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色细菌不易脱色。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第8页革兰染色意义判别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。选择抗菌药品：G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。了解细菌致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色步骤涂片→干燥→固定→染色脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第9页接种环取生理盐水3～4ul，2滴。菌苔少许（1mm小菌落半量）与盐水混匀，涂成＞1cm2。涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂→接种环烧灼灭菌。涂片制备甲→黄色，紫黑。乙→白色，粉红。丙→黄色，紫黑。丁→白色，粉红。↑细菌适当

↑细菌较多脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第10页涂片干燥固定Fixation手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速经过火焰外层3次，时间2～3秒钟。促使蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗时候，细菌被水洗掉。

脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第11页革兰染色方法步骤涂片→干燥→固定→↓结晶紫→初染1分钟→水洗→↓卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→↓95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→↓稀释复红→复染1分钟→水洗→↓吸干,镜检。★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。★影响革兰染色关键步骤是涂片和脱色。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第12页革兰阳性菌革兰阴性菌脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第13页G+链球菌G-双球菌G+杆菌G+短杆菌G-弧菌G-螺菌脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第14页液体培养基接种BrothTransfer—悬浮法SuspendingMethod甲→黄色,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉红。标识：组号，颜色37℃培养4小时4～5×108cfu/ml①接种环斜面取菌，在靠近液面管壁上，上下研磨接种。②在管壁上，将接种环内菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第15页生物安全警告此次试验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um经过呼吸道直接抵达肺泡。Pike博士对试验室感染统计分析结果发觉，不明原因感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引发。试验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持平静、有序，尽可能少说话、少走动，以免感染病原菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第16页显微镜油镜使用P1310×物镜→看清楚标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中（几乎与标本接触，工作距离0.13mm）→含糊物象→细调整调焦，观察物像→统计结果→关闭电源。将聚光镜调到最高处；孔径光阑环上刻有物镜倍率（10×，100×）必须转到正面，与使用物镜相对应。油镜处理：擦镜纸拭去香柏油→擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。显微镜罩上防尘罩→横放在试验柜内。★(顺德校区）试验台两侧电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近电源插座。★（校本部）试验台中间，三个位插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧插座。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第17页100倍浸油物镜使用方法油镜放入光路之前，一定要在标本观察部位上加一滴浸油。旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。假如浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜往返经过1～2次浸油，排除油内气泡。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第18页温馨提醒因染色场地受限，1～5组先涂片染色，后接种肉汤。6～10组先接种肉汤，后涂片染色。待染色和肉汤接种完成，桌面收拾洁净，才可镜检，以免污染。镜检过载玻片无须擦拭，直接投入玻片缸内消毒、灭菌。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第19页革兰染色法P15甲→黄色，紫黑乙→黄色，紫黑丙→白色，粉红丁→白色，粉红肉汤接种法P10

甲→黄色乙→白色丙→紫黑丁→粉红油镜使用P13

10×物镜→看到标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中→含糊物象→细调整调焦，观察物像→统计结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油→擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。聚光镜孔径光阑环上物镜倍率（10×或100×）必须转到正面。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第20页思索题革兰染色法关键步骤是什么?为何?染色时为何通常要用新鲜细菌培养物?怎样使用油镜?脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第21页脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第22页试验小结用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是经典葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（电镜）黄色、白色形态与染色（油镜）酸葡萄黄色、白色菌落特征黄色白色脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第23页葡萄球菌三个种判别试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血浆凝固酶+--甘露醇发酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--注：敏感（SensitiveS）,耐药（ResistantR）。脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第24页用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、取得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能判别是什么细菌。杆菌（电镜）紫黑、粉红细菌形态与染色（油镜）紫黑紫黑、粉红菌落特征粉红脓汁和粪便标本中病原菌的检测专题知识讲座第25页惯用器材摆放次序：电源插座→试管架→酒精灯→污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接