(16)-第11章2其他类型HPLC色谱法-分子排阻

第十一章其他类型高效液相色谱法分子排阻色谱法（体积排阻色谱法、分子筛色谱法）Size-ExclusionChromatography,SEC1分析样品：多肽、蛋白质、 多糖等生物大分子、 高聚物2溶质与固定相或流动相无相互作用的分离方式。一、概述3主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，即固定相（多孔凝胶）能有效的进行分子量大小的分离。4二、分离原理具有不同分子大小的样品通过柱时，溶质分子能够被柱填料的孔径分类。5二、分离原理大分子不能进入凝胶孔洞而被完全排除，只能沿着凝胶颗粒之间的空隙通过色谱柱，最先被流动相洗脱出来。6小分子能进入凝胶的绝大部分孔洞，在柱中收到更强的滞留，会更慢地被洗脱出来。7中等大小分子只能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，所以在柱中受到的滞留作用介于大分子与小分子之间。8溶解样品的溶剂分子，分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出。9VR:洗脱溶质的保留体积；Vm:色谱柱内凝胶颗粒之间的空间体积；Vs:凝胶内孔体积，即溶质分子可以渗透进去的体积洗脱体积VR＝Vm+KD·VsKD:溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数二、分离原理10当VR＝Vm说明溶质完全不进入凝胶内部，此现象称为全排斥，此也为凝胶的排阻极限。溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数KD二、分离原理KD＝011当VR＝Vm+Vs说明溶质完全进入凝胶内部，此现象称为全渗透，此也为凝胶的渗透极限。溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数Kd二、分离原理KD＝112大部分溶质：二、分离原理0<KD<1131）分离时间短，溶质谱带窄；2）根据分子大小，可预测分离时间；3）分离过程中无样品损耗和反应发生；4）柱几乎不失活，寿命长;5）特别适用在未知样品的探索分离优点：14葡聚糖凝胶三、固定相聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶二乙烯基苯型凝胶多孔玻璃凝胶软质凝胶，不耐压：中、低压色谱硬质凝胶，耐压半硬质凝胶15对样品的溶解性好2.由于高分子量样品的扩散系数小，应尽可能采用低粘度的溶剂3.与使用的凝胶固定相互相匹配，既要使凝胶浸润，又防止溶胀4.与所使用的检测器相匹配四、流动相16流动相为有机溶剂：凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography，

GPC）；流动相为水：凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography，GFC）17目的：用以测定分子量及分子量分布五、色谱柱的标定方法：用一系列已知分子量的标样制作标定曲线。18测定多糖的分子量与分子量分布－ChinaPharmacopoeia1)

系统校正：根据供试品分子量的大小，选用5个已知分子量的多糖标准品（如葡聚糖）作标定曲线。19lgMw=a+b*tRMw：标样的已知重均分子量202）样品测定取供试品溶液，进样，根据tR带入标定曲线，即可求出多糖的每个组分相应的分子量。21例1HPGPC测定雪莲口服液中多糖的分子量色谱柱为TSK-GelG4000PWXL（7.8mm×30.0cm），预柱TSK-GelG4000PWXL（6.0mm×4.0cm）；流动相为0.7%硫酸钠溶液（0.02%叠氮钠）；流速为0.5ml/min；柱温35℃；进样量20μl。22实验结果logM=9.077－0.2680tR，r=0.9993，保留时间代入上述标准曲线方程计算得其分子量为37199。23例2：

Chp2005Ⅱ部p137

－头孢曲松钠中头孢曲松聚合物的测定色谱柱：葡聚糖凝胶G-10(40~120μm)为填充剂流动相：pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液为流动相A；水为流动相B流速：1.5mL/min检测波长：254nm取0.1mg/mL蓝色葡聚糖2000试验色谱系统适用性，n>700，拖尾因子<2.0供试品中含头孢曲松聚合物以头孢曲松计，不得过0.5%。24例2：头孢曲松钠中聚合物的检查25色谱柱：Shodex

OHpakSB-804HQ流动相：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)；流速：0.5mL/min检测器：示差折光检测器例3：古糖酯脂质体的包封率测定26常规样品：色谱柱：反相键合相色谱：中性、小极性物质，极性物质改变流动相：离子抑制、离子对）正相键合相色谱：极性很大的物质硅胶色谱柱：分离异构体离子交换：极性很大的物质、生物大分子分子排阻：生物大分子

流动相：流动相组成：有机相比例，缓冲盐种类、比例，pH

流动相洗脱方式：等度、梯度洗脱

对映异构体：手性高效液相色谱HPLC条件的选择27《Practical