经前三剂止痛方活性部位治疗原发性痛经的机制分析,中医妇科论文

经前三剂止痛方活性部位治疗原发性痛经的机制分析,中医妇科论文原发性痛经在妇科病症中是常见病、多发病,经常影响人们工作、学习和健康,因而,引起人们的广泛关注,其发病机理有待于进一步研究。经前止痛方是以(删补名医方论〕所载fo手散为基础,临床加减使用治疗原发性痛经的方剂。处方中把当归和川芎根据3∶1比例配伍,重用当归为君药活血、养血、补血、和血对血瘀血虚之疼痛均有通和荣之效,并配以益母草、赤芍和桂枝等。以川芎、益母草为臣,行血活血,行气之郁,活血之瘀,共同起到养血和血行气化瘀止疼之效。赤芍凉血消肿、化瘀止痛为佐;以桂枝温通为使,缓拘急而止疼。全方共同起到养血行血和血,调经行瘀止痛的作用。JQF临床用药特点是,只在月经前3天使用本次月经无疼痛,连续服用3个月经周期,从第四个月经周期起停止服药,连续追踪3个月经周期,复发率低于4%。JQF-A-N-30、JQF-A-E是JQF的两个活性部位,本实验在前期研究基础上,为深切进入讨论该药的作用机制,并进一步了解前列腺素及雌激素、缩宫素受体在PD中的发病机理,本实验以阿司匹林为对照药,观察两个有效部位对痛经大鼠子宫组织前列腺素含量、雌激素受体(ER)、缩宫素受体(OTR)相关的影响。1、实验材料1.1实验动物SD雌性健康大鼠,未孕,体重选择在180~220g之间,在天津中医药大学二级动物实验室(实验动物中心)条件下饲养。提供单位:(合格证号:SCXK(京)2018-0002)中国医学科学院放射医学研究所动物室。1.2药物与试剂JQF基础方(当归、益母草、川芎、赤芍、桂枝),购自天津保康医院,并经生药学鉴定。JQF-A-N-30的制备:上述配方取各味生药,粉碎后用水煎煮3次,每次2h。滤液合并后浓缩并进行大孔树脂柱层析分离,依次以水、30%乙醇洗脱,30%乙醇洗脱部位经浓缩,冷冻枯燥为JQF-A-N-30,出膏率为1.98%。JQF-A-E的制备:按上述配方取各味生药,粉碎后用95%乙醇加热回流提取两次,每次2h,过滤后合并95%乙醇提取液,将乙醇提取液浓缩至无醇味,得乙醇提物JQF-A。将此醇提物经乙酸乙酷萃取,萃取液浓缩得JQF-A-E,出膏率为2.77%。上海一化药业有限公司生产的缩宫素注射液(10IU,1mL),(批号:040912);天津金耀氨基酸有限公司生产的己烯雌酚(diethylstilbestrol)注射液(0.5mg,1mL),(批号:0806021);石药集团欧意药业有限公司生产的阿司匹林肠溶片25mg/片(批号:018100725);大鼠前列腺素F2(PGF2)ELISA试剂盒(批号20180701A),大鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒(批号20180701A),均购自上海宝曼生物科技有限公司;2*taqplusPCRmasterMIX(批号K9104),QuantcDNA第一链合成试剂盒(批号:K9411):天根生化科技有限公司;PCR反响引物、1000bpDNALadderMarker:TaKaRa购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.3仪器设备匀浆机:IKAT-18basic;MVS-1,由北京北德科学器材有限公司生产的涡旋混合器;PCR扩增仪(HYBAID);离心机(美国BECKMAN);电泳仪(北京六一仪器厂);SYNGENE,GENEGENIUS凝胶成像分析仪。BECKMAN核酸蛋白分析仪,美国。2、实验方式方法2.1制作模型和分组灌胃制作雌性大鼠痛经模型:选取体重180~220g健康雌性大鼠(未孕),连续10d己以己烯雌酚皮下注射,第1、10两天皮下注射给药量为每只天天0.5mg,其余8日均为每只天天0.2mg,末次己烯雌酚注射后间隔40h,腹腔注射缩宫素2U/只(生理盐水稀释)。将大鼠分为JQF-A-N-30组、JQF-A-E组、模型对照组、阿司匹林对照组、正常对照组。JQF-A-N-30组、JQF-A-E组天天每只大鼠灌胃给予浓度为1.5g/mL的浸膏干粉1mL,阿司匹林对照组天天每只大鼠灌胃给予浓度为5mg/mL的阿司匹林片1mL,正常对照组、模型组天天灌胃等体积生理盐水,即连续10d,天天灌胃1次。2.2子宫组织PGF2、PGE2含量测定末次给予缩宫素1h后,将大鼠脱臼处死,解剖,分离出子宫,精到准确称取各组动物同侧同位段新鲜子宫150mg,生理盐水冲洗两次,加匀浆液(无水乙醇∶生理盐水=1∶9)2mL,以3000r/min,立即匀浆,离心10min(4℃),提取上清液体。用ELISA法测定PGF2、PGE2。2.3RT-PCR法考察JQF活性部位干涉对子宫组织OTR、ER-表示出的影响2.3.1引物序列与扩增片段长度见表1。2.3.2提取RNA和逆转录聚合酶链反响(RT-PCR)子宫组织RNA的提取:称取子宫组织80~90mg,按试剂盒讲明书提取总RNA。使用核酸蛋白分析仪对提取的RNA含量及纯度进行计算。RT反响:建立20L反响体系,使用PCR仪反响1h(37℃)。RT-PCR反响:建立25L反响体系,在RT-PCR仪上检测各样本基因表示出(条件见表1),以-actin作为内参照,取PCR产物,琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下检查有无特异性条带。在凝胶图像处理分析系统中扫描电泳带,以RNA含量=(目的基因-ac-tin)/-actin为公式,统计电泳带的积分值。3、统计方式方法使SPSS11.5统计软件进行数据处理,实验数据以x珋s表示,采用单因素方差分析LSD方式方法统计,组间比拟用Dunnettt检验。4、结果4.1JQF活性部位对痛经模型大鼠子宫中PGF2、PGE2含量变化的影响6结果表示清楚,模型组大鼠子宫组织PGF2含量明显高于正常对照组,与模型组比拟,阿司匹林阳性对照组、JQF-A-N-30的PGF2含量具有显著性差异(P0.01),JQF-A-E的PGF2含量亦有差异(P0.05);模型组大鼠子宫组织PGE2含量明显高于正常对照组,与模型组比拟,阿司匹林阳性对照组、JQF-A-N-30、JQF-A-E的PGE2含量有差异(P0.05),见表2。4.2JQF活性部位干涉对子宫组织OTR,ER一。表示出的影响见图1,表3。实验结果显示,模型组大鼠子宫组织OTR,ER一。基因表示出较正常组明显上调,与模型组比拟,阿司匹林阳性对照组、JQF-A-N-30、JQF-A-E的OTR、ER-基因表示出均有所降低,结果见表3。5、讨论当代医学研究发现,原发性痛经可能与ER、PG、OTR等因素有关,本实验采用酶免法对照观察了痛经大鼠子宫前列腺素含量(PGF2、PGE2)的变化,RT-PCR法检测了OTR、ER-的变化,结果表示清楚,JQF活性部位可显著降低ER、PG、OTR水平。病理状态下E2是促进子宫对OT的敏感性的重要物质,而且E2可增加大鼠子宫和人蜕膜培养物中缩宫素基因的表示出。OT直接作用在大鼠子宫平滑肌细胞引起宫缩,子宫内膜细胞遭到影响后使PGs水平升高,构成和加重疼痛。JQF活性部位可使PGF2所致的大鼠子宫肌痉挛直接得到抑制,有效缓解疼痛。实验显示:降低大鼠子宫组织PGF2水平是JQF活性部位治疗原发性痛经的作用机制。前期二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验,热刺激所致小鼠疼痛实验,痛经模型小鼠扭体反响实验和大鼠离体子宫实验等实验已经证明JQF-A-N-30、JQF-A-E能够显著抑制PGF2和缩宫素引起的子宫平滑肌条剧烈收缩,尤其对收缩频率加快的抑制作用较强,同时具有抗炎作用。本次实验通过ELISA法和RT-PCR法使其得到进一步验证。以下为参考文献：[1]方玲,尹菊,赖晓艺,等.经前三剂止痛方治疗原发性痛经疗效观察[J].中华中医药学刊,2018,29(11):2480-2481.[2]方玲,朱新冰,尹菊,等.经前三剂止痛方治疗实验性痛经模型大鼠作用机制研究[J].天津中医药,2018,27(1):46-49.[3]方玲,朱新冰,祝诚诚,等.经前三剂止痛方治疗原发性痛经的机制研究[J].中草药,2018,41(4):615-617.[4]DonghaoWang,JolantaGutkowska,MieczyslawMarcinkiewicz,etal.Genisteinsupplementationstimulatestheoxytocinsystemintheaortaofovariectomizedrats[J].CardiovascularResearch,2003,57:186-194.[5]刘芳,郑翠红,黄光英,等.Cx43对针灸治疗原发性痛经大鼠效应的影响[J].中国针灸,2008,28(10):751-755.[6]宋卓敏,屈彩芹,张远,等.痛经宁颗粒对痛经大鼠子宫雌、孕激素受体的影响[J].中华中医药杂志,2006,21(1):35-38.[7]RChibbar,SW