实验三培养基的制备及灭菌

实验三培养基的制备及灭菌第1页，共29页，2023年，2月20日，星期六一、实验目的1、了解培养基制备原理，学习并掌握培养基制备方法。2、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。第2页，共29页，2023年，2月20日，星期六二、基本原理（一）培养基的制备原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。从营养角度分析：♪营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等；♪适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；♪一定的氧化还原电位；♪合适的渗透压。第3页，共29页，2023年，2月20日，星期六琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。第4页，共29页，2023年，2月20日，星期六（二）灭菌原理1干热灭菌原理

干热是指相对湿度在20％以下的高热。干热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢。一般繁殖体在干热80－100℃中经1小时可以杀死，芽孢需160－170℃经2小时方可杀死。第5页，共29页，2023年，2月20日，星期六2湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌

在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

第6页，共29页，2023年，2月20日，星期六第7页，共29页，2023年，2月20日，星期六第8页，共29页，2023年，2月20日，星期六三、实验器材1、药品

琼脂，10％HCL，10%NaOH，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品。2、材料具刻度1000mL塘瓷量杯，天平，试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，药匙，pH试纸，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿等。3、设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。第9页，共29页，2023年，2月20日，星期六四、实验方法及步骤（一）培养基的制备

第10页，共29页，2023年，2月20日，星期六1、称量2、溶解3、调pH4、过滤5、分装6、加塞7、包装8、灭菌牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂20g水1000mlpH7.0~7.2121oC灭菌20min牛肉膏蛋白胨培养基制备步骤：第11页，共29页，2023年，2月20日，星期六马铃薯(PDA)培养基培养(霉菌用)制备马铃薯

200g蒸馏水

1000mL

蔗糖

20.0gpH

自然

琼脂

20.0g马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重量，切成小块,加水煮沸30min.调节pH值第12页，共29页，2023年，2月20日，星期六(4)过滤用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉花)趁热过滤。(3)在滤液中加入琼脂，煮沸溶解后加糖（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装。

(5)分装根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内,包扎管(瓶)口。第13页，共29页，2023年，2月20日，星期六斜面的摆法第14页，共29页，2023年，2月20日，星期六注意事项！（1）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。（2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/6~1/5

灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3

为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。（5）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干净的纱布擦干净。第15页，共29页，2023年，2月20日，星期六（二）灭菌

第16页，共29页，2023年，2月20日，星期六第17页，共29页，2023年，2月20日，星期六干热灭菌操作步骤：（1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条包好；用报纸条包好干燥的培养皿。（2）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。（3）开启电源，设定温度为160oC~170oC，保持此温度1~2小时。（4）切断电源，待温度降至70oC以下时，打开箱门，取出灭菌物品。第18页，共29页，2023年，2月20日，星期六第19页，共29页，2023年，2月20日，星期六湿热灭菌

湿热灭菌操作步骤：1、灭菌物准备（1）培养基准备（2）无菌水的准备

用100ml量筒量取90ml的自来水装入250ml的带玻璃珠的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮纸包好。第20页，共29页，2023年，2月20日，星期六2、高压蒸汽灭菌（1）加水：♫

将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加入适量的水，将内桶放入。（手提式锅）♫

直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。（立式锅）（2）装锅：把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖。第21页，共29页，2023年，2月20日，星期六（3）接通热源：打开排气阀，待见有大量水汽排出时，维持3～5min，锅内空气排尽，关上排气阀。（手提式锅）先将锅盖上排气阀关闭，同时打开底部排气阀。待见有大量水汽排出时，维持3～5min，关上底部排气阀。（立式锅）第22页，共29页，2023年，2月20日，星期六（4）升压、升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm2（温度为121℃）即灭菌开始，这时维持在1.05kg/cm2，20～30min。

除含糖培养基用0.56kg/cm2压力外，一般都用1.05kg/cm2压力。第23页，共29页，2023年，2月20日，星期六（5）切断电源：

达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到0时，打开排气阀。第24页，共29页，2023年，2月20日，星期六（6）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。（7）待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。第25页，共29页，2023年，2月20日，星期六注意事项！（1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌不彻底。（2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。（3）排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降会使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞。第26页，共29页，2023年，2月20日，星期六牛肉膏蛋白胨培养基配制任务：

100~150ml/250ml三角瓶.（4瓶/组）第27页，共29页，2023年，2月20日，星期六灭菌任务与完成步骤：1、装有玻璃珠的三角瓶装入90ml自来水。

1瓶/组2、培养基平均分装入三角瓶中。4瓶/组3、湿热灭菌。4、包移液管。

2支/人5、包培养皿。

2皿/人6、干热灭菌。第28页，共29页，2023年，2月20日，星期六五思考题及作业题1、培养微生物