目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学

目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学第1页/共39页基因文库第2页/共39页请你找找看……什么是基因文库，由哪两部分组成呢？构建基因文库由什么用呢？构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！第3页/共39页一．基因文库概述

1、概念基因文库(library)：一套包含某生物体所有基因的DNA序列。这些序列分别与适当的载体结合在一起。第4页/共39页2、基本组成包括：基因组文库、cDNA文库cDNA：由mRNA逆转录的DNA，因此不含非转录的基因组序列。单链cDNA可由DNA聚合酶转变成双链，应用于基因工程。

第5页/共39页基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息第6页/共39页cDNA文库（cDNAlibrary）

以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)将双链cDNA与适当载体连接转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库第7页/共39页基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列分离特定基因，cDNA库比较方便研究调控序列，必须用到基因组文库第8页/共39页3、构建目的创建基因文库的目的：从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。第9页/共39页4、基因文库的构建流程（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库第10页/共39页5、基因文库的质量标准尽可能高的完备性重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选第11页/共39页二、目的基因的克隆第12页/共39页用限制酶切断成许多片段1、直接分离法—“鸟枪法”载入运载体导入不同的受体细胞大量复制和表达找出含有目的基因的细胞限制酶将DNA切成许多片段第13页/共39页鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第14页/共39页2、人工合成基因法：1）逆转录法：mRNA双链DNA(即目的基因)逆转录酶单链DNA合成2）直接合成法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因（双链）化学合成第15页/共39页3、通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成

当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。第16页/共39页4、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段第17页/共39页5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受热变性，解旋；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ第18页/共39页(2)利用PCR技术扩增②原理：__________DNA复制③条件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做启动子)。已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增第19页/共39页⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第20页/共39页三、基因文库的构建（一）切割：基因组DNA的分解用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！第21页/共39页载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒第22页/共39页

上述几种载体的最大装载量如下：质粒l-DNA考斯质粒15kb25kb45kbYAC400

kb第23页/共39页

用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌第24页/共39页密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆二、筛选：从基因文库中筛选目的基因第25页/共39页从基因库中筛选特定的克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用DNA探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因文库第26页/共39页DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸单链、双链同位素标记、荧光标记、颜色标记第27页/共39页筛选文库质粒基因库筛选细菌混合液在培养在平板上转移到尼龙膜上裂解细菌变性DNA标记探针杂交漂洗放射自显影或荧光检测挑取对应菌落、培养抽提质粒第28页/共39页阳性克隆的分析与鉴定

从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因测序自动测序仪功能分析预测软件第29页/共39页磷酸二脂键第30页/共39页测序电泳图谱第31页/共39页基因测序及分析第32页/共39页序列测定的技术

杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:第33页/共39页与PCR反应类似。反应体系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；反应过程：变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧终止法第34页/共39页Dideoxynucleotides

（双脱氧核苷酸）ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：3~4)。第35页/共39页*少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较第36页/共39页Sanger第一步：加入复制终止剂