第十一章核酸物理化学性质

一.核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。第一页，共49页。第一页，共49页。酸易水解N-糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成嘌呤酸。碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即被水解，DNA对碱相对稳定。第二页，共49页。第二页，共49页。第三页，共49页。第三页，共49页。第四页，共49页。第四页，共49页。

酶水解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。核酸酶的分类按底物专一性分：以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。按作用方式分：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶，产物分别是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷第五页，共49页。第五页，共49页。核糖核酸酶举例牛胰核糖核酸酶（RNaseI）,内切酶，水解嘧啶3'-磷酸和其他核苷酸5'-OH形成的酯键，产生3'-磷酸核苷。核糖核酸酶T1，内切酶，发现于米曲霉，水解3‘-鸟苷酸与其他核酸5’-OH形成的酯键，产物为3‘-鸟苷酸为末端的寡核苷酸。第六页，共49页。第六页，共49页。脱氧核糖核酸酶举例1.牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseI），内切酶，水解DNA3‘-磷酸酯键，产生5’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸。2.牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseII），内切酶，水解DNA5‘-磷酸酯键，产生3’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个。3.限制性内切酶，可识别特异的碱基序列并水解断开，产物带5‘-磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶。N-糖苷酶水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸第七页，共49页。第七页，共49页。第八页，共49页。第八页，共49页。第九页，共49页。第九页，共49页。第十页，共49页。第十页，共49页。第十一页，共49页。第十一页，共49页。第十二页，共49页。第十二页，共49页。二.核酸的酸碱性质两性解离：DNA无，只有酸解，碱基被屏蔽（在分子内部形成了氢键）。RNA有两性解离，有pI。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的N及各取代基具有结合和释放质子的能力。核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力核酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两性解离主要决定于磷酸基和含氮碱基。

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三.核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外线下发出荧光。用A260/A280还可用来表示核酸的纯度：大于1.8，DNA很纯；大于2，RNA很纯。

第十四页，共49页。第十四页，共49页。样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显降低。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出含量。通常以A值为1相当于50µg/ml双螺旋DNA，或40µg/ml单链DNA（或RNA），或20µg/ml寡核苷酸计算。第十五页，共49页。第十五页，共49页。有时核酸的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数ε(P)。

ε(P)=A/cLA为吸收值，c为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。

c=每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（30.98）

ε(P)=30.98A/WL一般天然DNA的ε(P)为6600，RNA为7700-7800。核酸的ε(P)值较所含核苷酸单体的ε(P)要低40%-45%。单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的ε(P)要高，所以核酸发生变性时，ε(P)升高约25%，此现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。复性后ε(P)又降低，这现象称减色效应(hypochromiceffect)。第十六页，共49页。第十六页，共49页。四.核酸的变性，复性及杂交(一)变性稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的一级结构(核苷酸顺序)保持不变。变性表征

生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素

pH（>11.3或<5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度加热第十七页，共49页。第十七页，共49页。第十八页，共49页。第十八页，共49页。

热变性与TmDNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。（或者把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度）。一般DNA的Tm值在82-95C之间。第十九页，共49页。第十九页，共49页。第二十页，共49页。第二十页，共49页。DNA的Tm值大小与下列因素有关：（1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒的DNA，人工合成的polyd(A-T),polyd(G-C)熔解过程发生在一个较小的范围内。异质DNA熔解的过程发生在一个较宽的范围内。所以Tm值可作为衡量DNA样品均一性的标准。（2）分子中G和C的含量。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)Χ2.44（3）介质的离子强度。一般离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，而且溶解温度的范围较宽。第二十一页，共49页。第二十一页，共49页。第二十二页，共49页。第二十二页，共49页。第二十三页，共49页。第二十三页，共49页。第二十四页，共49页。第二十四页，共49页。盐浓度对DNA变性的影响第二十五页，共49页。第二十五页，共49页。第二十六页，共49页。第二十六页，共49页。RNA的变性：RNA也具有螺旋线团之间的转变。但这种较变不如DNA明显。变性曲线不陡，Tm值较低。tRNA具有较多的双螺旋区，所以具有较高的Tm值，变性曲线也较陡。第二十七页，共49页。第二十七页，共49页。第二十八页，共49页。第二十八页，共49页。第二十九页，共49页。第二十九页，共49页。

（二）复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度＝Tm－25℃复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度第三十页，共49页。第三十页，共49页。第三十一页，共49页。第三十一页，共49页。将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性DNA的片段越大，复性越慢DNA的浓度越大，复性越快在一定条件下，复性反应的速度用Cot1/2来衡量，Co为变性DNA复性时的初始浓度，t为时间，Cot½表示复性一半时的DNA浓度。两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的长短与基因组的大小有关有很多重复序列的DNA复性也快第三十二页，共49页。第三十二页，共49页。第三十三页，共49页。第三十三页，共49页。第三十四页，共49页。第三十四页，共49页。

（三）核酸的杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern杂交（Southernbolting）Northern杂交（Northernbolting）Western杂交（Westernbolting）第三十五页，共49页。第三十五页，共49页。核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术

核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

第三十六页，共49页。第三十六页，共49页。核酸的杂交第三十七页，共49页。第三十七页，共49页。<1>核酸分子杂交的意义：

发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的基因是断裂基因。

连续基因：基因中的bp序列能够连续的在成熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因能够和它的成熟mRNA形成平滑的杂交分子。

断裂基因：基因中的bp序列能够断续的在成熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因和它的成熟mRNA只能形成带泡的杂交分子。发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的RNA能够与人类正常的DNA分子形成带泡的杂交分子。

第三十八页，共49页。第三十八页，共49页。<2>核酸分子杂交的技术

SouthernBlotting（南印迹）：用于钓基因，即用已知的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因，方法如下：

未知的DNA--DNA限制性内切酶DNA片段琼脂糖电泳分离碱液变性影印在硝酸纤维薄膜上与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交放射自显影NorthernBlotting（北印迹）：用已知的DNA钓mRNA，方法如下：

众多未知的RNA电泳分离变性影印用标记的已知DNA单链杂交放射自显影WesternBlotting（西印迹）：蛋白质与抗体的杂交，跟核酸无关。第三十九页，共49页。第三十九页，共49页。第四十页，共49页。第四十页，共49页。

Southern

DNA印迹杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同位素标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。

第四十一页，共49页。第四十一页，共49页。Southern凝胶转移杂交技术（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同