细胞融合与单克隆抗体1课件

第三章细胞融合与单克隆抗体3.1细胞融合(cellfusion)定义:在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通过无

性方式融合成一个杂合细胞的技术。3.1.1细胞融合的发展历史“自发”细胞融合现象：1838年Muller多核的肿瘤细胞1858年Virchow正常组织、发炎组织及肿瘤组织——多核细胞1873年Luginbuhl天花病人——多核体血细胞1875年Lange蛙类血液细胞发生合并3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)重要事件1962年,(日)冈田善雄仙台病毒促细胞融合70年代,(华裔加籍)高国楠PEG促植物原生质体的融合80年代，电融合3.1细胞融合(cellfusion)植物细胞融合：1972年（美）P.S.Carlson——杂种烟草现代植物细胞融合的开始1978年（德）梅歇尔斯——“pomoto”3.1细胞融合(cellfusion)“Pomoto”3.1细胞融合(cellfusion)3.1.3动物细胞融合

动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。3.1细胞融合(cellfusion)肿瘤细胞与树突状细胞的融合3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)3.1.4细胞融合的诱导诱导融合的方法:物理法:电场刺激激光显微操作化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、高钙离子法生物法:仙台病毒3.1细胞融合(cellfusion)不同细胞融合的条件及其主要应用来源前处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒、PEG、电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG、电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PEG高产优质新菌种3.1细胞融合(cellfusion)融合的可能机制：

病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。3.1细胞融合(cellfusion)融合过程：1.病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞粘着成堆，在4℃冰浴中细胞紧密靠近，但不发生融合。2.37℃温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成通道，细胞质流通、融汇。3.病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过程约15～30分钟。4.细胞核也相互合并,完成细胞融合3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)融合的可能机制？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之故。

？3.1细胞融合(cellfusion)初步分析

可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。3.1细胞融合(cellfusion)PEG诱导过程注意事项：控制与分子量、浓度和处理时间悬浮法：将细胞悬于40～50％的PEG4000进行溶，处理1～2分钟为宜。离心法：先将细胞混合物悬于30～40％的

PEG4000，再离心进行融合，则可适当延长融合时间，以5～8分钟为宜。

3.1细胞融合(cellfusion)PEG融合法优点

效率高材料方便，操作简易效果稳定PEG融合法缺点

对细胞有毒性3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)电融合优点：融合效率高，可达50～80％产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。

操作简便、稳定，但需设备。对细胞无毒害作用。可在显微镜下观察操作。3.1细胞融合(cellfusion)融合率融合细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数

×100％融合率=3.1细胞融合(cellfusion)植物细胞融合基本过程去除细胞壁以获得大量的原生质体诱导细胞融合形成杂种细胞细胞相互靠近形成细胞桥–最关键的一步胞质渗透细胞核融合筛选,培养,促进细胞分裂,分化,从细胞团,愈伤组织到最后成株3.1细胞融合(cellfusion)动物细胞融合基本过程动物单个细胞的获得组织的获得组织的消化诱导细胞融合形成杂种细胞筛选，培养3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合的原理细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞融合的方法去处细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（显微操作、电融合）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体3.1细胞融合(cellfusion)影响细胞融合的因素(1)亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融

合；表面光滑者较难融合。(2)细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易

融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧

利希氏腹水癌细胞融合时，于37℃振摇时易于融合，且

融合效率与病毒量呈正比。但在34℃振摇则融合率下降。

在37℃时不振摇则几乎不融合。影响细胞融合的因素3.1细胞融合(cellfusion)(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大．缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生

变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+．但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度

一般为0.1mol/L(6)最适合的pH为7．4—7．8之间，在此范围之外，融合率均较

低。3.1细胞融合(cellfusion)融合细胞的特征及其意义染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失

3.1细胞融合(cellfusion)理论研究——基因定位和绘制基因图工作中十分有用应用价值——单克隆抗体

植物育种3.1细胞融合(cellfusion)融合细胞类型同核体（homokaryon）异核体(heterokaryon）多核体（polykaryon）异胞质体(heterocybrid)3.1细胞融合(cellfusion)

同核体(homokaryon)同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。3.1细胞融合(cellfusion)异核体(heterokaryon)

非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。3.1细胞融合(cellfusion)多核体(polykaryon)

含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。3.1细胞融合(cellfusion)异胞质体(heterocybrid)

不