10基因工程-基因文库的构建课件

第六部分基因文库的构建一、基因文库的概述二、基因组DNA文库的构建三、cDNA文库的构建1、基因文库(genelibrary)概念是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。一、基因文库的概述2、基因文库的分类基因组DNA：提取的染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。cDNA：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推导出来。基因组文库（genomiclibrary）含有全部基因。cDNA文库（cDNAlibrary）含有全部蛋白质编码的结构基因。(1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。基因组文库根据DNA来源分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库、线粒体基因组文库。克隆外源DNA片段的切割主要采用机械断裂或限制性部分酶解两种方法，其基本原则：①DNA片段之间存在部分重叠序列。②DNA片段大小均一。(2)cDNA文库(cDNAlibrary)：是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。基因组文库与cDNA文库的最大区别：基因组文库含有而cDNA文库不含有非转录的基因组序列。2023/4/1863、构建基因文库的基本方法将特定生物体的因组DNA或cDNA分解成适当大小的DNA片段,然后分别与克隆载体连接成重组DNA分子。通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。二、基因组文库的构建(一)基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。（三）基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。※(四)基因组文库构建的一般步骤

①载体的选择和制备。②高纯度、大分子量基因组DNA的提取。③基因组DNA的部分酶切与分级分离。④载体与DNA片段的连接。⑤转化或侵染宿主细胞。⑥筛选鉴定基因组及保存。

②基因组DNA的制备为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3－5倍），文库的重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得>100kb大小的DNA片段。AAAA③基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：①保证DNA片段之间存在部分重叠区。②保证DNA片段大小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法一般选用4碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！！！④载体与DNA片段的连接在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！方法一：粘末端连接方法二：人工接头法⑤转化或侵染宿主细胞在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的。进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！（六）构建基因组文库应注意的问题构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06。包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。2、酶切片段与载体连接⑴酶切片段及分离、纯化基因组的不完全酶切①根据实验需要选择合适的限制性内切酶—四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256—六个识别位点的限制酶出现的几率:1/1024②分离目的酶切片段大小的确定—克隆单个基因：<10kb—克隆基因族：<20kb③DNA不完全酶切条件的确定—确定限制酶用量，改变酶切时间—固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切酶切片段回收低熔点琼脂糖回收目的片段试剂盒回收目的片段⑵酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择：质粒载体可承载15kbDNA左右片段载体可承载25kbDNA左右片段Cosmid

载体可承载45kbDNA左右片段3、重组DNA转化受体细胞⑴根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5、HB101、JM101、JM109⑵重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation)2）转染法(transfection)3）转导法(transduction)②保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80℃保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。⑵基因组文库的筛选表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选。抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄。二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长。分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选。免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选。PCR筛选法：根据保守序列合成引物,扩增特异性片段。(八)用λ噬菌体载体构建基因组文库的步骤①准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右两臂。②纯化真核细胞高分子质量DNA，并用适当的限制性内切核酸酶部分消化。③分离适当大小的基因组DNA片段(20-24kb)。④连接载体与外源DNA。⑤连接产物体外包装及感染。⑥基因组文库的扩增。基因组文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装三、cDNA文库构建真核生物基因组大，结构复杂，含有大量的非编码区、内含子和重复序列等，直接利用基因文库很难分离得到目的基因。即使分离到DNA片段，也要同cDNA序列进行比较。mRNA是基因转录加工后的产物，且只在特定组织器官和发育时期表达。因此，从cDNA克隆文库分离基因更具优势。此外，mRNA决定了功能蛋白质的初始肽链的翻译，可以用来研究蛋白质的功能。(一)cDNA文库的特征从cDNA文库获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA,它不含真核基因的间隔序列及调控区,只反映mRNA的分子结构，并不是真正意义上的基因。cDNA文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因。基因总量少，显然比基因组DNA文库小得多，很容易从中筛选克隆得到细胞特异表达基因。cDNA文库是有时效性的，文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况并不能包括该生物有机体的全部基因，不同物种、不同组织的cDNA文库不同。(二)cDNA文库的用途cDNA文库可作为研究功能基因组学的基本手段。cDNA便于克隆和大量表达,因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。cDNA文库也可用于保护濒危珍稀生物资源，提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，可用于分离全长基因，进而开展基因功能的研究。cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有广泛的应用价值。(三)cDNA文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一链cDNA合成第二链cDNA合成双链cDNA的分级分离双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖重组体的筛选与鉴定1、细胞总RNA的提取和mRNA的分离mRNA的来源:选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。mRNA的制备:动物细胞或植物细胞mRNA的制备mRNA完整性的检测哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间。mRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离。可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA。2、第一链cDNA的合成oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA第一链缺点：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’末端，必须从3’末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分子无法达到5’末端。cDNA第一链的合成随机引物引导的cDNA合成法：根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’末端的oligo(dT)引物一处开始。比较容易合成特长的mRNA分子的5‘端序列随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。3、第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：

自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法。自身引导合成法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构，以此作为第二链合成的引物，在Klenow酶或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。自身合成法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失。置换合成法：cDNA第一链合成反应的产物cDNAmRNA不经变性直接与RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ混合，此时RNA酶H在杂合双链的mRNA链上产生缺口（内切作用）并形成部分cDNA单链区（外切作用）DNA聚合酶Ⅰ则以残存的mRNA作为引物合成cDNA第二链，最后用T4DNA连接酶修复缺口。用这种方法获得的cDNA双链分子含有残留的一小段RNA，但这并不影响后续的克隆操作。优点：cDNA双链合成效率高，操作简捷无需对第一链合成产物进行额外的变性处理，更重要的是避免了cDNA双链分子末端的缺损。置换合成法引物合成法：在第一链合成完毕后，变性残留的mRNA，用末端脱氧核苷酰转移酶在cDNA游离的3’羟基上添加同聚物（dC）末端，然后将之与人工合成的oligodG退火，形成引物结构，在Klenow酶的作用下合成第二条cDNA链。引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列引物-衔接头法4、双链cDNA的分级分离mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。优点：避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解增加了获得全长cDNA克隆的概率。获得更准确的分级分离效果（分子量）。5、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的。方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端。末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部。6、利用PCR技术构建cDNA文库能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。1、基因组文库的优点基因组文库的优点：基因组文库可以含有基因组的编码序列和间隔序列，用于研究基因编码序列和编码区外侧调控序列的