生物学免疫酶组织化学技术

生物学免疫酶组织化学技术第1页/共67页免疫酶组化免疫学(抗原抗体反应)

酶细胞化学(底物显色反应)+特异性敏感性定位性可视性第2页/共67页PAP法第3页/共67页免疫酶组织化学基本组成：抗原↓抗体↓放大系统↓显色系统第4页/共67页ABC法第5页/共67页免疫酶特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广第6页/共67页

一、酶及其特点酶选择标准：

★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。

★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。第二节酶和底物第7页/共67页

★酶易于纯化，获得纯制品。

★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。第8页/共67页符合上述条件：

辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶第9页/共67页（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色★

HRP穿透力强，易进入细胞内第10页/共67页

（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取

●组织穿透能力较弱

●内源性AKP较高

●左旋咪唑具有抑制作用第11页/共67页

（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定

●体内无内源性GOD

●分子量大，穿透力较弱第12页/共67页

二、底物及其特点酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色）第13页/共67页HRP的底物：

HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。第14页/共67页HRP显色反应：

HRP＋H2O2HRP＋H2O＋电子供体（氧化型）电子供体第15页/共67页

电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。第16页/共67页HRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)～黄色第17页/共67页AKP底物：

AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色第18页/共67页第三节酶标记抗体法酶标记抗体法（EnzaymeLabelledantibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。第19页/共67页一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---

抗体●HRP复合物第20页/共67页组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法第21页/共67页步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。第22页/共67页二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●

HRP复合物步骤：二步法第23页/共67页组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法第24页/共67页特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。第25页/共67页第四节酶抗酶法●制备抗酶抗体●制备PAP复合物第26页/共67页酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP第27页/共67页一、PAP法原理：抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP复合物步骤：三步法第28页/共67页组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP第29页/共67页特点：

敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物第30页/共67页二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP---第二抗体---PAP复合物

第31页/共67页组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP第32页/共67页双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP第33页/共67页步骤：五步法特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特异背景重第34页/共67页三、APAAP法原理：抗原---特异抗体---第二抗体---APAAP复合物步骤：三步法第35页/共67页APAAP法第36页/共67页特点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂第37页/共67页

第五节卵白素---生物素

Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力第38页/共67页一、ABC法

AvidinBiotinComplex原理：酶标记Biotin形成酶素化

Biotin第39页/共67页

酶素化Biotin＋Avidin---ABC

复合物抗原---特异抗体---Biotin标记第二抗---Avidin●Biotin●HRP第40页/共67页组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素ABC法第41页/共67页步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强，应用范围广第42页/共67页

●某些脏器存在内源性生物素干扰●

Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应第43页/共67页SABC法

StreptavidinbiotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABC法第44页/共67页

二、LSAB法

LabelledStreptavidinBiotinMethod原理：●

Biotin标记第二抗体第45页/共67页LSAB法第46页/共67页●HRP标记Avidin

抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin●HRP复合物第47页/共67页步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强，方法简便第48页/共67页第六节多聚合物酶法

HRP---多聚合物---抗体

一、Epos法

Enhancedpolymerone-stepstaining第49页/共67页多聚合物酶法第50页/共67页组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法第51页/共67页原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成

HRP---多聚合物---特异性抗体。第52页/共67页步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵第53页/共67页二、EnVision法

EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚合物---第二抗体第54页/共67页组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVisionTM方法第55页/共67页特点：敏感性高：（1mole复合物中含70moleHRP和10mole第二抗体）特异性强：复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。第56页/共67页第七节基本操作步骤

1.抗原修复2.内源性过氧化物抑制3.正常血清封闭4.第一抗体5.第二抗体6.酶标记体7.DAB-H2O2显色第57页/共67页第八节抗原定位及非特异染色

第58页/共67页

组织细胞

＊固定问题

＊脱蜡不彻底

＊内源性过氧化物

＊内源性生物素第59页/共67页抗原

＊抗原弥散

＊抗原异常表达

＊共同抗原决定簇第60页/共67页特异性抗体

＊非特异吸附

＊抗体不纯

＊交叉反应第61页/共67页

第二抗体

＊