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![PCR基因扩增课件_第2页](http://file4.renrendoc.com/view/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a8/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a82.gif)
![PCR基因扩增课件_第3页](http://file4.renrendoc.com/view/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a8/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a83.gif)
![PCR基因扩增课件_第4页](http://file4.renrendoc.com/view/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a8/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a84.gif)
![PCR基因扩增课件_第5页](http://file4.renrendoc.com/view/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a8/d8e2cb87b854d2c0436d67c864bbf5a85.gif)
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文档简介
PCR基因扩增一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法,由美国人B.Mullis于1983年发明包括三个基本步骤:变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则:引物长度约为16~30bp引物中G+C含量通常为40%~60%,可按Tm=4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度四种碱基应随机分布,在3’端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对在引物内,尤其在3’端应不存在二级结构两引物之间尤其在3’端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量引物5’端对扩增特异性影响不大,可引入酶切位点或突变位点引物不与模板结合位点以外的序列互补简并引物应选用简并程度低的密码子引物的浓度一般为0.1~0.5μmol/L,引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增,引物浓度偏低则降低产量dNTPdNTP常用的浓度为20~200μmol/,而且4种dNTP的终浓度相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入dNTP浓度过高虽可加快反应速度,但会增加碱基的错误掺入率,同时会抑制TaqDNA聚合酶的反应活性;适当的低浓度会提高反应的精确度注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系Mg2+Mg2+浓度会影响TaqDNA聚合酶的活性、真实性,影响引物退火、解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等通常Mg2+浓度范围为0.5~2mmol/L在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度模板PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板DNA(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)模板的数量和纯度均会影响PCR结果:一般反应中的模板数量为102
~105个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物模板DNA中的杂质也会影响PCR的效率反应缓冲液一般含100mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8),500mmol/LKCl和0.1%的明胶,有时候还有适当浓度的Mg2+Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液,主要靠其调节pH,使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性KCl有利于引物的退火,但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性明胶保护酶不变性失活Mg2+影响TaqDNA聚合酶的活性,直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性2、PCR反应参数变性退火延伸循环次数退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高有些反应可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(如用60℃和94℃)完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃~55℃,1-2min延伸延伸反应温度通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃~85℃,引物延伸在退火时即已开始延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10~30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要循环次数当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度一般而言25~30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加通常25~30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103~105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109~10105’3’5’3’DesignprimerswiththissequenceinformationIdenticaltothissequenceReversecomplementofthissequenceDoublestrandedDNAtemplate5’3’5’3’PCRCycle1PrimersTaqTaqDoublestrandedDNAtemplate5’5’3’3’PCRCycle1Denaturation95℃
strandsseparate
PrimersTaqTaqTaqpolymeraseisthermostable3’5’5’3’Annealing~55℃TaqbindsTaqTaqPCRCycle13’5’5’3’Extension72℃Taqcopies
DNA
strand
dNTPsTaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’direction
PCRCycle13’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃Taqcopies
DNA
strand
dNTPs3’5’5’3’TaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1TaqTaqExtension72℃Taqcopies
DNA
strand
dNTPs3’5’5’3’5’3’5’3’Endcycle1
PCRCYCLE13’5’5’3’5’5’3’3’Annealing~55℃PrimersbindPCRCycle2Extension72℃TaqcopiesDNAstrandPCRCycle2TwosinglestrandsofcorrectlengthPCRCycle2Endcycle2
Endcycle3
Endcycle4
FollowingncyclesofPCRtherewillbeNo(1+Y)ncopiesNo initialnumberoftargetsY efficiencyofPCRreactionn cyclenumber三、仪器、材料与试剂PCR热循环仪移液枪(配套枪头)DNA模板(质粒R-pGEX-4T-1,R指代外源基因)2.5mmol/LdNTP(TaKaRa)10×PCR缓冲液(TaKaRa)25mmol/LMgCl2(TaKaRa)引物1、引物2(5pmol/μL)引物1:5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’引物2:5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’TaqDNA聚合酶(TaKaRa)四、实验步骤PCR反应体系的配制,即在0.5mLEppendorf管内配制25μL反应体系,按下表准确加入各反应物反应物体积(μL)10×PCR缓冲液2.525mmol/LMgCl21.52.5mmol/LdNTP2.0引物12.0引物22.0TaqDNA聚合酶0.2模板DNA(1ng/μL)2.0加ddH2O至25μL12.8PCR反应条件的设置,即在PCR热循环仪上设置程序,按程序设置的条件进行扩增94℃预变性5min
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