实验9,10酶切和连接课件

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。DNA克隆（重组）技术DNA克隆（重组）技术的基本程序包括：（1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。（3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。（4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。（5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。实验九质粒酶切与鉴定一.实验目的了解质粒酶切鉴定原理。掌握核酸片断回收纯化操作技术3.学习核酸片断连接的原理和方法二.实验原理(质粒酶切与鉴定)使用限制性内切酶获得粘性末端的目的基因核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。

限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。如：NotI的识别序列和切口是：

限制性内切酶切口酶切片段电泳凝胶的区带数,酶切片段大小3．试剂

（1）限制性内切酶NotI及相应的缓冲液；

（2）电泳试剂1xTBE缓冲液

EB染色液(0.5μg/mL)。四.操作步骤1.反应体系的建立：

⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：

无菌双蒸水10.5μl

10×酶切缓冲液2μl

质粒DNA(100ng/μl)7μl

NotⅠ(10U/μl)0.5μl

总体积为20μl

⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。4．DNA琼脂糖凝胶电泳检测

（1）水平放置胶槽，放入合适的梳子。（2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g琼脂糖，置于三角瓶中，加入30mLTBE缓冲液，微波炉加热融解，待冷却至65℃左右加入2ulEB，将凝胶液缓慢倒入胶槽，室温下静置30min，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，将胶板放在电泳槽中使用。

（3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。（4）电泳

120V电泳，当指示剂前沿移动至距离胶板1~2cm处，停止电泳。

（5）观察

紫外等下观察琼脂糖凝胶中的DNA条带。

实验十DNA片断的回收纯化及连接DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。连接酶：把基因连在一起二.仪器和试剂1.仪器：离心机，水浴锅，电泳仪2.材料：待回收DNA样品

3.试剂：

1)DNA回收试剂盒

2）T4DNA连接酶

3）10XT4DNAligasebuffer：Tris-HCl（pH7.6）；MgCl2；DTT；ATP。5）取回收试剂盒中吸附柱EC装在2ml收集管上，将上一步所得溶液加入吸附柱EC中。室温放置1min,

12000rpm离心1min,弃去收集管中平衡液，将柱子套回；6）加入700ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心1min，弃去废液；7）加入500ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心1min，弃去废液；8）将吸附柱EC装回收集管上，12000rpm离心2min甩干柱子中残液；9）将吸附柱转移到1个干净的1.5mleppendorf管中，加入50ul洗脱缓冲液EB至柱子底部膜中央，室温放置2min,12000rpm离心1min，收集离心液为洗脱的DNA.2.片断与载体连接反应1）连接反应液的制备：加入含有质粒载体的DNA溶液：2μl；插入片段DNA溶液：5μl；

10XT4DNAligasebuffer：1μl；

T4DNA连接酶：0.5μl

灭菌的双蒸水：1.5μl

总体积为10μl

涡旋后混合均匀，涡旋至无气泡。2）16℃反应过夜。注意：DNA纯化回收后,电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带,那么回收后电泳结果可能会出现两条以上