酶细胞原生质体固定化

酶细胞原生质体固定化1第1页，共106页，2023年，2月20日，星期二直接应用酶的不足之处酶的稳定性差一次性使用分离纯化较困难2第2页，共106页，2023年，2月20日，星期二固定化酶的优点酶的稳定性明显改善；酶的利用效率高；易于分离纯化；反应条件易于控制；适合于多酶催化反应。3第3页，共106页，2023年，2月20日，星期二第一节酶固定化定义酶的固定化:是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。

固定化酶:固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶;概念发展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”4第4页，共106页，2023年，2月20日，星期二什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术5第5页，共106页，2023年，2月20日，星期二化学偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶6第6页，共106页，2023年，2月20日，星期二固定化酶制备原则（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。7第7页，共106页，2023年，2月20日，星期二酶的固定化方法（一）固定化方法分类非共价结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法化学结合法交联法共价结合法包埋法微囊法网格法一、酶固定化的方法8第8页，共106页，2023年，2月20日，星期二酶固定化方法示意图9第9页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、吸附法(link)2、包埋法(link)3、结合法(link)4、交联法(link)5、热处理法(link)go一、酶固定化的方法10第10页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、吸附法通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.back11第11页，共106页，2023年，2月20日，星期二吸附法12第12页，共106页，2023年，2月20日，星期二2、包埋法包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等(1)凝胶包埋法(2)半透膜包埋法13第13页，共106页，2023年，2月20日，星期二14第14页，共106页，2023年，2月20日，星期二2、包埋法(1)凝胶包埋法天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化15第15页，共106页，2023年，2月20日，星期二如:天然高分子衍生物:

纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙16第16页，共106页，2023年，2月20日，星期二凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点17第17页，共106页，2023年，2月20日，星期二①聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml15％的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25℃：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒．于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。(1)凝胶包埋法18第18页，共106页，2023年，2月20日，星期二聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺凝胶包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED19第19页，共106页，2023年，2月20日，星期二海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控20第20页，共106页，2023年，2月20日，星期二海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2

溶液中IE(orIC)21第21页，共106页，2023年，2月20日，星期二卡拉胶包埋法：卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将酶在37-50℃溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40-60℃溶于生理盐水中，二者混合后，趁热滴在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。22第22页，共106页，2023年，2月20日，星期二

卡拉胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)(1)凝胶包埋法23第23页，共106页，2023年，2月20日，星期二(2)半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性底物和产物都是小分子物质的酶2、包埋法24第24页，共106页，2023年，2月20日，星期二微型胶囊法25第25页，共106页，2023年，2月20日，星期二微胶囊型固定化酶制备酶+亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液混合乳化剂乳化酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋Tween-20破乳离心半透膜酶液滴26第26页，共106页，2023年，2月20日，星期二3、结合法选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法酶载体(1)离子键结合法载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落27第27页，共106页，2023年，2月20日，星期二(1)离子键结合法28第28页，共106页，2023年，2月20日，星期二(2)共价键结合法载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;也可分三类:天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）方法载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性3、结合法29第29页，共106页，2023年，2月20日，星期二载体活化方法1、重氮法;2、叠氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.30第30页，共106页，2023年，2月20日，星期二重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团31第31页，共106页，2023年，2月20日，星期二叠氮法含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物32第32页，共106页，2023年，2月20日，星期二溴化氰法含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物33第33页，共106页，2023年，2月20日，星期二烷基化法含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体back34第34页，共106页，2023年，2月20日，星期二4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等酶双功能剂35第35页，共106页，2023年，2月20日，星期二双功能试剂：

常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H4、交联法36第36页，共106页，2023年，2月20日，星期二

戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。

此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。37第37页，共106页，2023年，2月20日，星期二38第38页，共106页，2023年，2月20日，星期二戊二醛:优点：结合牢固，可以长时间使用缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用39第39页，共106页，2023年，2月20日，星期二酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶back40第40页，共106页，2023年，2月20日，星期二5、热处理法在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内适用性热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间back41第41页，共106页，2023年，2月20日，星期二

酶的四种固定化方法42第42页，共106页，2023年，2月20日，星期二43第43页，共106页，2023年，2月20日，星期二44第44页，共106页，2023年，2月20日，星期二固定化方法吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备难易易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较45第45页，共106页，2023年，2月20日，星期二固定化方法的比较吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。46第46页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、稳定性(link)2、最适温度(link)3、最适pH(link)4、底物特异性(link)

go二、固定化酶的特性47第47页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、稳定性相对游离酶的优点（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度A固定化酶B游离酶48第48页，共106页，2023年，2月20日，星期二（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.1、稳定性49第49页，共106页，2023年，2月20日，星期二

可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。1、稳定性50第50页，共106页，2023年，2月20日，星期二2、最适温度与游离酶差不多A固定化酶B游离酶51第51页，共106页，2023年，2月20日，星期二例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10℃;以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15℃；汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80℃，比固定化前提高了30℃同一种酶2、最适温度52第52页，共106页，2023年，2月20日，星期二不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度(back)载体方法最适温度(℃）游离60DEAE-葡聚糖凝胶离子键结合法72DEAE-纤维素离子键结合法67DEAE-葡聚糖凝胶烷基化法<6053第53页，共106页，2023年，2月20日，星期二3、最适pH值酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移，原因是微环境表面电荷性质的影响pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响54第54页，共106页，2023年，2月20日，星期二带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微环境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变55第55页，共106页，2023年，2月20日，星期二(2)产物酸碱性对最适pH值的影响酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低中性:固定化酶的最适pH值一般不变原因:载体障碍产物的扩散(back)56第56页，共106页，2023年，2月20日，星期二4、底物的特异性与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用(back)57第57页，共106页，2023年，2月20日，星期二影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化58第58页，共106页，2023年，2月20日，星期二59第59页，共106页，2023年，2月20日，星期二60第60页，共106页，2023年，2月20日，星期二三、固定化酶的应用1、工业生产(link)2、酶传感器(link)3、药物控释载体（link)

go61第61页，共106页，2023年，2月20日，星期二现已用于工业生产的固定化酶主要有：氨基酰化酶葡萄糖异构酶天门冬氨酸酶青霉素酰化酶延胡索酸酶β－半乳糖苷酶天冬氨酸―β―脱羧酶固定化酶在工业生产上的应用62第62页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、固定化酶在工业生产中的应用(1)氨基酰化酶Aminoacylase首例，1969年，日本田边制药公司，DEAE-葡聚糖凝胶固定化酶,拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-aa，成本降低40%左右。乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala63第63页，共106页，2023年，2月20日，星期二泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala64第64页，共106页，2023年，2月20日，星期二(2)葡萄糖异构酶世界上生产规模最大。热处理法进行固定化。1973年，已用于工业化生产。国内外广泛研究和应用。1、固定化酶在工业生产中的应用65第65页，共106页，2023年，2月20日，星期二(3)天冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌，采用包埋法，将延胡索酸转化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合法。1、固定化酶在工业生产中的应用66第66页，共106页，2023年，2月20日，星期二(4)青霉素酰化酶1973年，催化青霉素或头孢菌素水解6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA),也可催化6-APA或7-ACA与其他羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素;(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制造L-苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌。1977年，由延胡索酸制L-苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄色短杆菌1、固定化酶在工业生产中的应用67第67页，共106页，2023年，2月20日，星期二(6)ß-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶(7)天门冬氨酸-ß-脱羧酶1982年，天门冬氨酸生产L-丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋Back1、固定化酶在工业生产中的应用68第68页，共106页，2023年，2月20日，星期二2、固定化酶在酶传感器方面的应用酶传感器：固定化酶+能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管)，属于生物传感器的一种酶电极:固定化酶+电极，应用最广泛;用途:临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测go69第69页，共106页，2023年，2月20日，星期二生物传感器用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理、化学传感器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控手段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法;在未来21世纪生物经济发展中，生物传感技术将是介于信息和生物技术之间的新增长点;中国生物传感器的研究起步于70年代末期。早期研究普遍采取氧电极作生物反应中的换能器,以葡萄糖氧化酶为活性材料1、概述70第70页，共106页，2023年，2月20日，星期二生物传感器(续)传感器能将一种被测信号（参量）转换成一种可输出信号的装置。生物传感器(biosensors):用生物成分作为感受器的传感器。由感受器、换能器、电子线器组成2、生物传感器组成和工作原理71第71页，共106页，2023年，2月20日，星期二感知固定化配基与待测物结合产生的微小变化，把这种变化转化为其它可识别信号，其质量好坏决定了传感器的灵敏度。换能器是生物传感器的心脏，整个生物传感器的核心技术也在此。制备分两方面工作，一是选择最佳载体材料（需活化）；二是在载体表面固定化亲和配基（非共价和共价）感受器72第72页，共106页，2023年，2月20日，星期二食品鲜度鱼鲜度传感器在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示：K=肌苷+次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黄嘌呤+尿酸73第73页，共106页，2023年，2月20日，星期二大多数鱼死后5～20h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP--肌苷---次黄嘌呤---尿酸。将这三个步骤的三种酶（5’－核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。当K＜20时，鱼极新鲜，可供生食。

K在20～40之间为新鲜，必须熟食。

K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。74第74页，共106页，2023年，2月20日，星期二肉鲜度传感器肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。75第75页，共106页，2023年，2月20日，星期二污染微生物及病原菌的检测1通过免疫学方法，即获得相应的特异性抗原和抗体进行分析和检测。76第76页，共106页，2023年，2月20日，星期二葡萄糖氧化酶电极1962年Clark和Lyons提出模型1967年Updike和Hicks首先制造聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜强度20-50μm基本结构酶膜+多分子膜(聚四氟己烯等)+氧电极葡萄糖氧化酶电极77第77页，共106页，2023年，2月20日，星期二

半透膜 酶胶层

感应电极

酶电极示意图ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O78第78页，共106页，2023年，2月20日，星期二葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌葡萄糖氧化酶氢醌 醌＋2H＋＋2e－Pt铂电极79第79页，共106页，2023年，2月20日，星期二GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode

根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。第80页，共106页，2023年，2月20日，星期二脲电极Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH381第81页，共106页，2023年，2月20日，星期二青霉素酶电极酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝胶(或光交联树脂)电极:pH电极结合:酶膜紧贴在玻璃(pH)电极上反应:青霉素+H2O青霉烷酸+H+青霉素酶82第82页，共106页，2023年，2月20日，星期二3、药物控释载体药物应用临床不顺利的原因:蛋白类药物被胃酸破坏被肝和血液中的酶系统清除药物本身毒副作用免疫问题药物稳定性差建立合理的给药体系，核心是从时间和空间分布上控制药物的释放83第83页，共106页，2023年，2月20日，星期二3、药物控释载体控释体系涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，也称载体药物(1)聚合物修饰(2)凝胶包埋(3)微球制剂(4)脂质体(5)导向药物Back84第84页，共106页，2023年，2月20日，星期二4、固定化酶在医学上的应用（1）消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。85第85页，共106页，2023年，2月20日，星期二（2）人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。86第86页，共106页，2023年，2月20日，星期二第二节细胞固定化分类方式固定化细胞分类方式固定化细胞细胞类型微生物植物动物生理状态死细胞:完整细胞,细胞碎片,细胞器活细胞:增殖细胞,静止细胞,饥饿细胞87第87页，共106页，2023年，2月20日，星期二⒈固定化细胞的定义

固定在载体上并在一定空间范围内能进行生命活动的细胞。

固定化活细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。第二节细胞固定化88第88页，共106页，2023年，2月20日，星期二⒉固定化细胞的特点细胞特性+生物催化剂+固相催化剂①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③比固定化酶稳定性高④细胞内酶附助因子可再生⑤细胞本身含多酶体系⑥抗污染能力强优点89第89页，共106页，2023年，2月20日，星期二一、细胞固定化的方法吸附法包埋法90第90页，共106页，2023年，2月20日，星期二1、吸附法

酵母细胞：pH3-5多孔陶瓷植物细胞：中空纤维动物细胞：91第91页，共106页，2023年，2月20日，星期二2、包埋法琼脂凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法角叉菜胶包埋法明胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶