生物化学氨基酸与蛋白质

生物化学氨基酸与蛋白质第1页/共117页

在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。一、

结构域domain，motif(模块)第2页/共117页

结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。结构域一般有１００－２００氨基酸残基。结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例：脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口第3页/共117页第4页/共117页★EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构★锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn。★亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，第5页/共117页第6页/共117页二、三级结构●整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。●三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。第7页/共117页

大的球形蛋白(200氨基酸以上)，常常含有几个结构域。1、三级结构的特点

许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在三级结构上相距很近。

球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。第8页/共117页主要是二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。2、维持三级结构的作用力氢键范德华力分子间及基团间作用力定向效应：极性基团间诱导效应：极性与非极性基团间分散效应：非极性基团间疏水相互作用离子键盐键共价健第9页/共117页第10页/共117页5、表面常常有空穴，配体结合部位（活性中心）三、球状蛋白质三维结构特征1、含有丰富的二级结构元件2、具有明显的折叠层次3、分子呈现球状或椭球状4、疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在外表第11页/共117页第七节亚基缔合与四级结构

第12页/共117页☆有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。有时也把原体称为单体。一、有关四级结构的一些概念1、亚基与单体2、单体蛋白质3、原体（protomer)

四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为亚基（或单体），亚基一般由一条多肽链组成。只有一个亚基的蛋白质称为单体蛋白质。第13页/共117页二、四级结构缔合的驱动力疏水作用极性基团之间的氢键和离子键二硫桥第14页/共117页1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3、提高基因编码的效率和经济性。4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6、适当降低溶液渗透压。7、具协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节四、四级缔合在结构和功能上的优越性第15页/共117页别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。五、

寡聚蛋白与别构效应别构蛋白

除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。别构效应第16页/共117页就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。同促效应（同位效应）

一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰。异促效应（异位效应）第17页/共117页正协同效性一种配基的结合促进后续配基的结合，S型配体结合曲线。负协同效性一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。正效应物促进活性部位与配基结合的别构效应物。负效应物抑制活性部位与配基结合的别构效应物。第18页/共117页第七节

蛋白质结构与功能的关系第19页/共117页一.同功能蛋白质中氨基酸的种属差异二.进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化三.蛋白质结构变化引起功能变化四.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活第20页/共117页一.同功能蛋白质中氨基酸的种属差异（比较生化）

相关研究表明，不同来源的同功能蛋白质的化学结构基本相同，氨基酸种类和顺序也基本相同，只有少数几个氨基酸有相互差异，这些差异不影响功能，仅表现其种属的不同；如不同生物来源的胰岛素：同工（同源）蛋白质：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质(如血红蛋白)。第21页/共117页不同种属来源的胰岛素中AA顺序的部分差异

胰岛素来源

氨基酸顺序的部分差异A8A9A10B30人苏丝异亮苏猪苏丝异亮丙狗苏丝异亮丙兔苏丝异亮丝牛丙丝缬丙抹香鲸苏丝异亮丙：第22页/共117页二.进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化（一级结构的种属差异与分子进化）

在生物进化过程中同功能蛋白质的结构随生物进化也在不断进化；第23页/共117页二.进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化

同源蛋白质是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质(如血红蛋白)。

同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属是相同的，称不变残基；(invariantresidue)；而其它位置的氨基酸对不同的种属有相当大的变化，称可变残基

(variableresidue)；同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性称为顺序同源(sequencehomology)。第24页/共117页

不同种属来源的细胞色素c(cytochromec)中，可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。第25页/共117页生物名称与人不同的氨基酸数目生物名称与人不同的氨基酸数目黑猩猩0鸡13恒河猴1响尾蛇14兔9海龟15袋鼠10金枪鱼21鲸10蝇25牛，猪，羊10小麦35马12酵母44不同生物细胞色素C的氨基酸差异第26页/共117页

从表中可以看出，亲缘关系越近的物种，其细胞色素C的结构差异越小；亲缘关系越远，结构差异越大。

所以可以通过细胞色素C的结构分析来核对生物进化的分类关系，以及各个物种在进化过程中的分歧时间；第27页/共117页三.蛋白质结构变化引起功能变化

蛋白质有什么样的结构，就有相应的功能。如果结构发生了变化会引起相应的功能变化。这方面最突出的例子是分子病。1.一级结构的变异与分子病:第28页/共117页

在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响。

被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基改变所造成的。第29页/共117页12345678正常：N－缬－组－亮－苏－脯－谷－谷－赖…..贫血病：N－缬－组－亮－苏－脯－缬－谷－赖…..

镰刀形细胞贫血病：病人的红血球在缺氧时变成镰刀形，其病因在于细胞的血红蛋白的一条链上的第六位谷氨酸被缬氨酸取代，从而形成异常血红蛋白：

由于病人的红血球形状异常，故不能输送氧气，造成病人在幼年时即致死；第30页/共117页第31页/共117页血红蛋白β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异，它变异来源于基因上遗传信息的突变。第32页/共117页2.变构蛋白：能通过构象变化来改变生物（生理）特性（活性）的蛋白质；（变构酶分子构象变化活性变化生化反应变化）

3.蛋白变性与复性：

a.变性:理化因素引起的蛋白空间结构解体及活性丧失;(可逆、不可逆)b.复性：引起蛋白空间结构解体的理化因素消失，蛋白结构、活性恢复;第33页/共117页四.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活

在动物体内的某些生化过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现出活性（血液凝固的生化机理

酶原的激活）

蛋白质的这一特性是在生物进化过程中发展起来的，具有重要的生物学意义；第34页/共117页第八节

个别蛋白质的结构与功能第35页/共117页8段直的α-螺旋组成，分别命名为A、B、C…H，拐弯处是由1~8个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。4个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。

血红素辅基，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。一、肌红蛋白的结构与功能1、肌红蛋白的三级结构肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。球状分子，单结构域。第36页/共117页第37页/共117页His93His64第38页/共117页p255第39页/共117页2、肌红蛋白的氧合曲线第40页/共117页二

血红蛋白的结构与功能在血液中结合并转运O2第41页/共117页▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似。1、血红蛋白的结构成人：HbA：α2β298%，

HbA2：

α2δ22%胎儿：HbFα2γ2早期胚胎：α2ε2第42页/共117页第43页/共117页第44页/共117页第45页/共117页第46页/共117页2、血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线。第47页/共117页肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的比较第48页/共117页增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放；反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+和CO2

。3、波耳效应及其生理意义血红蛋白上有CO2和BPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2

。波耳效应第49页/共117页BPG是血红蛋白的负效应物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。

BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPG升高。（2）血库储血时加入肌苷可BPG。4、BPG的别构效应BPG2,3-二磷酸甘油酸第50页/共117页★协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率第51页/共117页三、

免疫球蛋白的结构与功能1、抗原与抗体抗原

抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。第52页/共117页抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。抗原决定簇抗原决定簇的作用①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。②与相应抗体的Fab结合。第53页/共117页抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，也称免疫球蛋白。抗体的特点高度特异性多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10，000种抗体存在。第54页/共117页第55页/共117页第56页/共117页第57页/共117页★抗原抗体反应的条件：①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键等）2、抗原抗体反应★抗体是2价的，抗原是多价的。★抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。★抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。★抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。第58页/共117页第59页/共117页基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法酶联免疫吸附测定（ELASA）Western印迹(Westernblot)第60页/共117页第61页/共117页第62页/共117页第九节

蛋白质的分离、纯化和表征第63页/共117页一、

蛋白质的酸碱性质和等电点等电点对于某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等（即净电荷为零），这一pH称为蛋白质的等电点。等离子点中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-

、HPO42-）影响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为0时的等电点称等离子点。等电点测定方法溶解度法聚焦电泳法第64页/共117页★化学组成法测定最低分子量★SDS法★凝胶过滤法★渗透压法★扩散系数法★沉降系数法和沉降平衡法二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法第65页/共117页1、根据分子组成测定最小分子量例如肌红蛋白含0.335%的铁最低相对分子量＝Fe分子量Fe(%)×100%=55.80.335=16,700第66页/共117页2、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量第67页/共117页3.根据渗透压测蛋白质的分子量

用一半透膜将蛋白溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：C：浓度（克/升）R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温度）T：绝对温度（开氏温度）：以大气压表示的渗透压第68页/共117页4.用SDS—PAGE测定蛋白质的分子量SDS—PAGE即十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳第69页/共117页③质点大小在1-100nm，可以进行布朗运动三、

蛋白质的胶体性质与选择性沉淀

蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①蛋白质表面极性基团形成的水化膜②非等电状态时，同种电荷的互相排斥。第70页/共117页2、选择性沉淀蛋白质的方法盐析法大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。有机溶剂沉淀法破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等重金属盐沉淀pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+等）结成不溶性沉淀。第71页/共117页生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加热变性沉淀等电点沉淀法第72页/共117页

指因某些物理、化学因素的影响，使蛋白质的生物学活性丧失。四、

蛋白质的变性第73页/共117页

强酸和强碱；有机溶剂：破坏疏水作用；去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；盐浓度：盐析、盐溶；重金属离子：Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。温度；机械力：如搅拌和研磨中的气泡。1、变性的因素第74页/共117页★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性★2、蛋白质变性后出现的现象①生物活性丧失②硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。③溶解度降低、沉淀，粘度增加。3、蛋白质变性的实质次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。但变性不涉及一级结构的破坏不可逆变性蛋白质变性可逆变性第75页/共117页前处理粗分级细分级浓缩保存五、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质增加制品(preparation)的纯度或比活性。纯化的一般程序第76页/共117页电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析第77页/共117页1、前处理①将组织和细胞破碎超声波震荡、与砂研磨高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）动物组织和细胞电动捣碎机（waringblender)匀浆器（homogenizer)超声波处理（ultrasonication)植物组织和细胞石英砂+提取液，研磨纤维素酶处理微生物细胞第78页/共117页②差速离心法收集细胞的某一组分③如果提取膜蛋白，超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取第79页/共117页①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法④热处理选择性沉淀法⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法2、粗分级（roughfractionation)一般用选择性沉淀法第80页/共117页3、细分级（finefractionation)首先采用透析或sephdexG-25凝胶过滤除盐。层析法凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）电泳法自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳等。密度梯度离心第81页/共117页第82页/共117页4、保存晶体保存

结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。冻干粉保存溶液保存加入抗冻剂（50%甘油）后-20至-70℃保存。第83页/共117页★根据蛋白质的溶解度分离★根据电荷差异分离★根据分子大小分离★根据配体特性异性分离（亲和层析）★选择性吸附分离（物理吸附）★根据疏水性的差异

六、

分离纯化蛋白质的主要方法第84页/共117页盐析法PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法

（pH＞＞pI，蛋白质带负电荷）生物碱和酸选择性沉淀法

（pH＜＜pI，蛋白质带正电荷）热处理沉淀法（铜锌SOD，65℃、15分钟、稳定1、根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法第85页/共117页

在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。等电点沉淀在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。第86页/共117页蛋白质的盐溶与盐析盐溶低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。盐析高盐浓度时，使蛋白质溶解度↓析出，称盐析。盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液第87页/共117页2、根据分子大小和形状的差异透析超滤密度梯度离心凝胶过滤法第88页/共117页交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，）

琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）第89页/共117页第90页/共117页第91页/共117页交联葡聚糖（Sephadex）的分子结构第92页/共117页从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE，琼脂糖胶，淀粉胶等）3、根据电荷性质的差异电泳和等电聚焦普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳第93页/共117页等电聚焦电泳法测定蛋白质pI第94页/共117页第95页/共117页第96页/共117页第97页/共117页第98页/共117页2Dgelinproteomics第99页/共117页离子交换纤维素：离子交换交联葡聚糖：离子交换交联琼脂糖：离子交换层析法第100页/共117页第101页/共117页第102页/共117页第103页/共117页交联葡聚糖离子交换剂第104页/共117页4、根据选择性吸附的差异：吸附层析法极性吸附