生物制品的制备详解

生物制品的制备详解第1页/共45页一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法

（1）原料选择原料的选择原则：

①有效成分含量高，新鲜；②原料来源丰富，产地较近；③原料中杂质含量少；④原料成本低等。

第一节一般生物制品的制备方法第2页/共45页

①植物原料生长的季节性；②微生物原料的对数期；③动物原料的年龄与性别。原料的选择注意事项：第3页/共45页①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。

（2）原料的预处理：第4页/共45页①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。

原料的保存方法：第5页/共45页生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。二、生物制品的提取

第6页/共45页细胞破碎定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度第7页/共45页动物细胞:多分泌到细胞外培养液植物细胞:多为胞内产物微生物（细菌/真菌）:胞内、胞外

对于胞内产物需要进行细胞破碎。

不同类型的细胞分泌目标产物的类型：第8页/共45页胞外：大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。胞内：有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。第9页/共45页细胞破碎方法细胞破碎方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶学破碎法第10页/共45页一、机械破碎方法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。常用的仪器高速组织捣碎机匀浆器研磨器第11页/共45页二、物理破碎方法通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。物理破碎方法多用于微生物细胞的破碎。第12页/共45页物理破碎法的分类物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法第13页/共45页三、化学破碎方法化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。十二烷基硫酸钠：SDS第14页/共45页四、酶学破碎方法酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜分为：外加酶制剂和自溶法。第15页/共45页自溶作用

自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。第16页/共45页（2）提取（extraction）

生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，

①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。

②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。

③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。第17页/共45页

包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等。2.超滤法和透析法、凝胶层析法、超速离心法等：按分子大小分离的方法。第二节各类生物制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法第18页/共45页3.离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法等是按分子所带电荷进行分离的方法，氨基酸、多肽、蛋白质、酶均具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。4.亲和层析法大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。第19页/共45页核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。二、核酸类制品的分离纯化方法

第20页/共45页基因工程产物的特点：产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎产物浓度较低，杂质多，提纯困难产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活第三节基因工程制品的分离纯化方法P79NP98第21页/共45页1.含目的产物的起始物料的特点①菌种类型及其代谢特性。②原材料和培养基的来源及其质量；③生产工艺和条件。④初始物料的物理、化学和生物学特性。目的产物的表达特性。目的产物本身的分子特性。目的产物的用途和需求量。一、影响分离纯化工艺设计的主要因素（P79，NP98）第22页/共45页分离纯化的基本过程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。第23页/共45页分离纯化一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。第24页/共45页发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂

产品一般制品分离纯化的一般流程第25页/共45页1、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物：发酵液的体积很大、但目标产物浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。产物在周质表达：为了获得周质蛋白，E.coli经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透压裂解的方法来获得，能够回收到高质量的产物。可溶性表达产物：破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。二、选择分离纯化方法的依据P80，ＮＰ99第26页/共45页应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。2、根据分离单元之间的衔接选择第27页/共45页分离单元之间的链接：Ｐ80，ＮＰ100①先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；②随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；③凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。第28页/共45页分离纯化工艺应遵循以下原则：（1）工艺条件应温和，具有良好的稳定性和重复性：不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步骤和技术（2）尽可能减少组成工艺的步骤：步骤越多，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质量3、根据分离纯化工艺的要求来选择第29页/共45页（3）组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调（4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加步骤，或干扰产品质量（5）时间要尽可能短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品质量会下降（6）必须高效、收率高、易操作，对设备条件要求低，能耗低（7）具有较高的安全性：药品必须保证安全、无菌、无热原、无污染第30页/共45页三、各种不同表达形式的产物采用的分离纯化方法（P81，ＮＰ101）（一）细胞内不溶性产物——包含体（或包涵体）大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物——包含体以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离第31页/共45页（二）分泌型的表达产物（P83，NP103）分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行浓缩浓缩方法包括：沉淀、超滤第32页/共45页（三）细胞内可溶性表达产物可获得高纯度、高活性的目的蛋白质第33页/共45页（四）细胞周质表达蛋白周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压裂解法获取。由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。第34页/共45页第35页/共45页分离纯化主要依赖色谱分离方法。该法是设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为①离子交换色谱、②疏水色谱、③反相色谱、④亲和色谱、⑤凝胶过滤色谱、⑥高压液相色谱等。选择纯化方法尤其重要的根据是表面性质的差异。四、色谱法p84第36页/共45页一、原材料的质量检测与控制原材料的质量控制是要确保编码生物制品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。第四节生物制品的质量检测与控制

P90，ＮＰ111第37页/共45页

在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制第38页/共45页产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。三、纯化工艺过程的质量控制

第39页/共45页1、产品的鉴别2、纯度分析（1）目的蛋白质含量测定：SDS、等电点聚焦、HPLC、毛细管电泳等。（2）杂质：①蛋白类杂质②非蛋白类杂质。3、生物活性测定4、安全性评价5.稳定性检测6、产品一致性的保证四、目标产品的质量控制P93,NP114