生化工程培养基灭菌

生化工程培养基灭菌第1页/共66页培养基灭菌程度N/N0培养基灭菌程度的要求因发酵系统而异。某些培养过程，由于培养基中的基质不易被一般微生物利用,或温度、pH不适于一般微生物的生长，则对无菌程度要求低；但是有一些培养过程对无菌程度要求高，例如抗生素的生产过程。第2页/共66页

第一节

分批灭菌

一、微生物的热死灭动力学对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。

ln(N/N0)=-Kt均相系统，它符合化学反应的一级反应动力学。第3页/共66页K（比热死亡速率常数）由两个因素均定1、微生物的种类2、灭菌温度。第4页/共66页

ln(N/N0)

=-K

tln(C/C0)

=-Kdt杂菌营养物质△T，△K，

△Kd也就是K对T的变化率是怎么样的？第5页/共66页灭菌动力学的重要结论

细菌孢子热死灭反应的△E很高，而大部分营养物质热破坏反应的△E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)

=-K

t）；由于营养成分热破坏的△E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。第6页/共66页第一节

分批灭菌

二分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行灭菌，也称实罐灭菌。优点：（1）不需专门的灭菌设备。（2）对蒸汽的压力要求较低，在3～4×105Pa（表压）就可满足要求。缺点：在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。第7页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作

第8页/共66页第9页/共66页第10页/共66页第11页/共66页高压蒸汽锅第12页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计2、分批灭菌的设计要求绝对的无菌在工业上很难做到，因为：N=0，则e-kt=0,1/ekt=0,

ekt=∞,t=∞

因此，绝对的无菌很难做到。第13页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计

而且绝对的无菌也是不必要的，工程上只要求培养基中杂菌降低到合理的程度，然后进行细胞的培养，失败的可能性很小。那么无菌程度降低到多少为好呢？有一个设计标准（判据）N0：未灭菌培养基的含菌数。N：灭菌后培养基中存活的菌体数，

第14页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计常取N=10-3个/罐。它的意义是：灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐=

那么为计算方便Ln（N0/N）=36.8

第15页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。第16页/共66页T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0Ln(N0/N1)Ln(N2/

N)Ln(N1/

N2)LnN0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的ln（N0/N）=ln（×

×）

lnN0/N

=ln

+ln+ln第17页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计

在灭菌过程中，必需设计出灭菌过程的操作时间和温度。

首先根据培养过程对培养基无菌程度的要求提出无菌判据（ln），然后依据所使用的灭菌设备，和设计出的灭菌温度和时间来计算出实际的ln，看能否达到开始提出的无菌要求。第18页/共66页ln(N0/N1)=K(t1-t0)K是变数，t变化，T变化，K也变化。

升温段：T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/

N)ln(N1/N2)第19页/共66页T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/

N)保温段：Ln(N1/N2)=K(t2-t1)T一定，K是常数。

ln(N1/N2)降温段：这三个判据中，保温段可以算出，升温段和降温段不好办，因为不知道T和t之间的函数关系。第20页/共66页是否有这样的函数关系呢？一些学者已经作出的常用的换热方式T-t关系式。第21页/共66页除了这种积分方式以外，工程上还常用图解积分法，即从设计的T-t数据换算成K-t数据，进行图解积分。第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计第22页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计例如：某发酵罐分批灭菌最高温度120℃，保持5min，设计的温度和时间关系如下：（A=7.94×1038min-1；△E=278441J/mol;R=8.28J/mol·K）t0103036435055586370102120140T30509010011012012011010090604433K00

00.030.363.593.590.360.03

0

0

0

t：min,T:℃,K:min-1,发酵罐60m3，N0=105个/ml，N=10-3问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？

第23页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计解：先计算无菌程度的判据：

N0/N=6×1015ln(N0/N)=36.3K的数据值是由已知数据计算出的根据已有的数据作出T-t和K-t图第24页/共66页ln(N0/N3)=ln(N0/N1)+ln(N1/N2)+ln(N2/N3)=36.3ln(N1/N2)=K·△t=3.59×5=17.95

第25页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计ln(N0/N1)+ln(N2/N3)按图解积分，求得

:ln(N0/N1)+ln(N2/N3)=15.85ln(N0/N3)=t=34min以前和t=64min以后，K值太小，忽略不计.没有达到N3=10-3的要求,残留菌数N3=N0e-Kt=N0e-33.8=1.26×10-2第26页/共66页第一节

分批灭菌二分批灭菌的设计保温阶段对杀死孢子的贡献:17.95/33.8=53%，而保温阶段时间只有5min。那么如何改进设计呢？(1)

增加保温时间，如果增加1min,那么ln(N1/N2)=3.59×6=21.54

那么ln(N0/N3)=21.54+15.85=38.39，达到了设计要求。

(2)可以提高灭菌温度。间歇灭菌的提温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小，而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。第27页/共66页第二节

连续灭菌一、连续灭菌方法

第28页/共66页第29页/共66页第30页/共66页第31页/共66页第32页/共66页第二节

连续灭菌一、连续灭菌方法

与间歇灭菌相比，连续灭菌的优点：1升温和降温速度快2灭菌温度高，保温时间短3蒸汽用量平稳缺点：1设备复杂，投资大。第33页/共66页第二节

连续灭菌一、连续灭菌方法空罐灭菌加热器、维持罐和冷却器也先进行灭菌。耐热性物料和不耐热性物料可分开灭菌。糖和氮源分开灭菌。第34页/共66页第二节

连续灭菌二、连续灭菌反应器的流体流动模型

τ=

式中：反应器中液体所占的体积（L，m3）Q：通过反应器的流体流速（L/min，m3/min）在设计连续灭菌设备时，必须认识到并不是培养基的每一质点都在反应器中停留同样的时间。第35页/共66页活塞流（理想）滞流，V=0.82Vmax湍流,V=0.5Vmax实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布）。第36页/共66页第二节

连续灭菌实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布），这就必然造成物料间的（轴向）混合，这样就不能保证物料先进的先出，后进的后出，那么有的物料灭菌时间长，有的灭菌时间短，有的物料达到了灭菌要求，而有的没有达到，由此我们在设计反应器时，一定考虑到这个现象，引入的τ概念。第37页/共66页第二节

连续灭菌返混现象：

反应器中停留时间不同的物料之间的混合称为返混。按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型。连续搅拌罐（CSTR）和活塞流反应器（PFR）反应器返混为∞

返混为零

第38页/共66页第二节

连续灭菌

在实际反应器中，其返混程度总是处于两种模型之间。搅拌良好的反应器接近于CSTR，管式反应器和填充床反应器返混程度较小，接近于PFR反应器。这两种模型都可用于培养基灭菌以及微生物的培养。第39页/共66页第二节

连续灭菌

（1）PFR模型（活塞流）plugflowreactor

物料沿同一方向以相同速度向前流动，在流动方向上没有物料返混，所有物料在反应器中的停留时间都是相同的。（长径比很大的管式反应器，没有弯头、阀门、管件、接近于PFR模型）第40页/共66页第二节

连续灭菌

（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactor恒温热灭菌状况：1同一截面上活孢子浓度（N）相等，热死灭速率相等。2沿流动的方向，活孢子浓度（N）下降，热死灭速率也相应下降。第41页/共66页第二节

连续灭菌

（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactor求算N、t、L的数学关系方法：对反应器进行物料衡算。培养液通过PFR全反应器所达到的灭菌程度的计算：先对微元物料衡算，再沿流动方向的长度积分。第42页/共66页物料衡算通式：进入量=排出量+反应量+积累量dv足够小，可以认为在此微元内N相等，热死灭速率处处相等，是均一体系。QN=Q（N+dN）+KNAdl+0A为横截面积整理得：QdN=-KNAdl第43页/共66页第二节

连续灭菌

（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactorQdN=-KNAdl∵

∴

，积分

结论：活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分批灭菌效果相同。

第44页/共66页第45页/共66页第二节

连续灭菌

（2）CSTR模型（全混流模型）

ContinuedflowStirredTankReactor第46页/共66页连续搅拌罐反应器的结构基本上与间歇操作的搅拌罐反应器相同。两者的根本差别在于：1连续操作。2反应器内料液组成（等于出料液组成），不随时间而变化。搅拌强烈的实际连续反应器（机械搅拌、气流或液流搅拌）可以接近于CSTR特性。

第47页/共66页第二节

连续灭菌

（2）CSTR模型（全混流模型）求算N、t、V的数学关系方法：对整个反应器进行物料衡算。物料衡算通式：进入量=排出量+反应量+积累量

QN0=QN+K·N·V+0整理QN0=N（Q+K·V）

第48页/共66页QN0=N（Q+K·V）第二节

连续灭菌

（2）CSTR模型（全混流模型）第49页/共66页第二节

连续灭菌

CSTR和PFR灭菌效果的比较PFR:e-kt

=要达到相同的灭菌效果，即需要的灭菌时间长？一定，那么哪一种反应器结论：CSTR需要的时间长。CSTR：第50页/共66页第二节

连续灭菌

（3）多级全混流釜模型

MultipleCSTRsinseries

在工程实践中常将几个CSTR反应器串联使用，来接近PFR的效果。

tN0

活塞流多釜串联

多级全混流釜串联模型及其浓度分布图第51页/共66页MultipleCSTRsinseriesτ为每个串联反应器的平均停留时间。如果让多级全混流釜模型有PFR效果，则：=t=nτ，∴（1+Kτ）n=ekτn

当τ=0，n=∞时，有活塞流的效果。第52页/共66页第二节

连续灭菌

（4）扩散模型返混：是不同反应时间的物料之间的混合。PFR：返混程度最小CSTR：返混程度最大高/径↑，返混程度↓高/径↓，返混程度↑实际操作的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间。第53页/共66页

返混是个复杂的现象，到目前为止还不能用数学解析的方法表示出来，在实际的工程中，又要涉及到这个问题，怎么办？把这个复杂的现象用数学模型表示，使简单的模型和复杂的系统具有等效性。扩散模型第54页/共66页活塞流

扩散流动

流体在管内流动，由于分子扩散和涡流扩散的作用使一部分流体质点返混了回去，这个过程简化为在活塞流动中叠加了一个与流动方向相反的扩散。第55页/共66页费克定律：扩散通量（沿轴方向）=DeDe：轴向扩散系数cm2/sC：质点浓度个/cm3

L：扩散距离cm扩散通量的物理意义：

单位时间内，单位面积通过的质点个数，单位：个/scm2

。第56页/共66页

把这两种流动叠加，对进出任一微元体积的活孢子数进行衡算。

AUc+ADe（c+dc）=AU(c+dc)+ADe+K·c·A·dl+0进入的离开的死掉的积累的整理为：De

-u-Kc=0第57页/共66页整理为：常系数齐次线性二阶微分方程式中c：活孢子浓度（个/cm3）

De：轴向扩散系数（cm2/s）

L：轴向长度cm把参数变成无因次式：设定一个准数：

=∞时是活塞流（De=0，无返混）

=0时是全混流（De=∞全是混返，最大）

第58页/共66页把上面的关系代入微分方程，整理得：这是常系数二阶齐次线性微分方程

特征方程：r2-Nper-NpeKτ=0r1，2=，r1≠r2

是两个不相等的实根∴微分方程的通解为：第59页/共66页需确定c1，c2边界条件：l=0，即=0时，=1L=L，即=1时，=0，因此时N很小，反应速率趋于零。C1+C2=1联立解方程：第60页/共66页解得：

其中δ=，Npe=可见不但是Kτ的