理化生讲基因工程操作程序

理化生讲基因工程操作程序第1页/共34页生物选修31.2基因工程的基本操作程序专题1基因工程第2页/共34页目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第3页/共34页阅读与思考1、什么是目的基因？2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？第4页/共34页一、目的基因的获取1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成第5页/共34页从基因文库中获取目的基因基因文库：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）第6页/共34页基因文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部DNA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增第7页/共34页基因文库的构建过程mRNA单链DNA

双链DNA逆转录cDNA文库第8页/共34页如何从基因文库中找到所需要的基因？依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性。从基因文库中获取目的基因第9页/共34页第10页/共34页利用PCR技术扩增目的基因PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：

DNA复制

PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。第11页/共34页模板原料引物酶控制温度利用PCR技术扩增目的基因——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段——耐热的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：第12页/共34页PCR的过程：利用PCR技术扩增目的基因变性(90-95℃)复性(55-60℃)(退火）延伸(70-75℃)第13页/共34页用化学方法直接人工合成条件：基因较小，核苷酸序列已知。第14页/共34页二、基因表达载体的构建—核心用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒第15页/共34页二、基因表达载体的构建—核心第16页/共34页二、基因表达载体的构建—核心目的基因第17页/共34页二、基因表达载体的构建—核心1、基因表达载体的组成目的基因启动子:终止子:标记基因、复制原点等一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。第18页/共34页启动子的作用：二、基因表达载体的构建—核心终止子作用：使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。

是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。第19页/共34页二、基因表达载体的构建—核心2、基因表达载体的构建目的：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因能够表达和发挥作用。第20页/共34页三、目的基因导入受体细胞

1、什么是转化？

2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？

3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？

4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？第21页/共34页转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。三、目的基因导入受体细胞第22页/共34页1.目的基因导入植物细胞常用的方法:

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌的特点:a.易感染双子叶植物和祼子植物。b.具有趋化性。c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上三、目的基因导入受体细胞第23页/共34页三、目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程:构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达第24页/共34页２.目的基因导入动物细胞常用的方法:

显微注射技术操作程序：三、目的基因导入受体细胞a.先提纯含目的基因的表达载体b.从动物体内取出卵(受精卵）c.显微注射仪进行显微注射d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体第25页/共34页3.目的基因导入微生物细胞原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。大肠杆菌的转化过程:用Ca2+处理细胞增加细胞壁的透性，与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞→

感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子第26页/共34页四、目的基因的检测与鉴定1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？第27页/共34页1.目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上目的基因的检测内容和方法检测方法:DNA分子杂交技术DNA探针：用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。四、目的基因的检测与鉴定第28页/共34页DNA分子杂交技术基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。第29页/共34页2.目的基因是否转录出mRNA目的基因的检测内容和方法检测方法:分子杂交技术用DNA探针与mRNA杂交。四、目的基因的检测与鉴定第30页/共34页目的基因的检测内容和方法检测方法:抗原—抗体杂交3.目的基因是否翻译出蛋白质四、目的基因的检测与鉴定第31页/共34页4、个体生物学水平的鉴定如抗虫、抗病的接种实验四、目的基因的检测与鉴定