DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

/山东大学实验报告2013年m月22日至11月19日涔姓名—系年级2011级生技一班学号201100140112组别_四题目DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定同组者一、【实验目的】学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。掌握对DNA进行限制性内切酶酶切的实验技术。学习和掌握DNA连接酶的作用原理以及利用TDNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术。4学习和掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理与方法。学习和掌握热激法转化E.coli感受态细胞的原理与方法。掌握a-互补筛选法的原理。学习用试剂盒提取质粒DNA的方法。复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。二、【实验原理】通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。限制性核酸内切酶（1）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链^入分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）°I型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，I型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp；而II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，11型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。III型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。限制-修复系统：在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。限制作用的本质是限制性核酸内切酶的切割反应，修饰作用的本质是甲基化酶的甲基化作用，这两种酶分别为宿主hsdR和hsdM基因的产物，它们作用时的位点识别需要hsdS基因产物的协助。II型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶的命名普遍采用H-Smith和D-Nathaus于1973年提出的命名系统，根据分理出该酶的微生物的学名进行的，通常为3个字母：第一个字母大写，用斜体，来自微生物属名的第一个字母；第二、第三个字母小写，用斜体，来自微生物种名的头两个字母，如果该微生物有不同的变种和品系，则再加一个来自变种或品系的第一个字母，大写还是小写应根据具体情况而定，但要用正体；从同一种微生物中发现的几种限制酶，则根据其被发现和分离的顺序用I、II、III等罗马数字表示，用正体。例如从E.coli(Escherichiacoli)R株中发现并分离的第一种限制酶被称为EcoRI。限制性核酸内切酶的基本特点位点特异性：绝大多数的II型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，这些特定的序列大多呈回文结构，我们称这样的序列为限制性核酸内切酶的识别序列。不过有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。同裂酶和同尾酶：有一些来源不同的限制酶能识别同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶，同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。与同裂酶对应的一类限制性核酸内切酶，它们来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的黏性末端，称为同尾酶。由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点，称之为杂种位点，但是这类杂种位点的结构，一般是不能够再被原来的任何一种同尾酶所识别的。限制性核酸内切酶对DNA底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响：DNA纯度：在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。②核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可采用以下三种方法进行消化反应:先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化;先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。③酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素.不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度.多数限制内切酶的最适反应温度是37°C,少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37C。④DNA的分子结构：DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍.有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异.限制性内切酶反应的终止。限制性核酸内切酶的星号活性限制性核酸内切酶通常有严格的识别特异性，能精确地识别DNA排列顺序。但在某些反应条件下，如离子强度降低、pH增大、辅因子(Mg2+被其他二价阳离子取代、有机溶剂污染、甘油浓度过高和限制酶过量等，酶识别顺序的特异性可能发生变化，通常是特异性降低，可识别和切割额外的位点，这种特异性降低的内切酶活性被称为“星号活性”。星号活性主要是由以下一些因素引起的：①甘油浓度过高②离子强度不合适③二价阳离子变化④溶液pH变化⑤有机溶剂的残留。DNA酶切体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目6的)NA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。单酶切法：：如果目的DNA片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA分子的工作量大很多。单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同,这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化;先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。酶切和连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的数量，以及相应的酶量。一般的，酶切0.2-1.0ug的DNA分子时，反应体积约为15-20ul，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参考标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1ugpBR322DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，将会抑制酶的活性。DNA连接(1)DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA片段的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接°T4DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。DNA连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸内切酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂交DNA分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3种体外连接DNA片段的方法：①用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；②用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNApoly（dA）-poly（dT）尾之后，再用DNA连接酶连接起来；③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA连接酶连接起来。这3种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。（2）连接反应外源DNA片段与载体分子的连接，即DNA分子体外重组，主要依赖于DNA连接酶来完成。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自丁4噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式主要有以下几种：互补粘性末端片段之间的连接当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为2:1（插入片段摩尔数:载体摩尔数）。平末端及非互补黏性末端片段之间的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。既然在一定反应条件下，用T4DNA连接酶可以将平末端的DNA片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的S1核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4DNA连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。（3）连接反应的体系的反应条件连接酶：从理论上讲，酶浓度高，催化的反应速度快，产量也高。但是酶是保存在50%的甘油中的，添加过多的酶，会使连接反应体系甘油含量过多而影响连接的效率。底物浓度:一般采用提高载体DNA和外源DNA的浓度来提高重组效率，但是底物浓度过高，连接效果也会受影响，而且载体DNA自连的概率和外源DNA多拷贝插入的概率也会提高。将载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1-3）之间可以有效地解决外源DNA多拷贝插入的现象。缓冲液：商品连接酶都配有现成的连接酶反应的缓冲液，Mg2+ATP等为辅助因子，其中ATP提供能量；DTT为酶的活性稳定剂；BSA用于维持蛋白浓度，防止酶的变性失活。反应条件：连接反应所用的连接酶的最适反应温度是37oC，但是在这个温度下，黏性末端的氢键结合是不稳定的，一般中间四个互补碱基对的结合不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此实际操作过程中，黏性末端DNA分子之间连接反应采用介于酶作用速率和末端结合速率之间的温度，一般为16oC，平末端适当提高连接反应温度，一般选择20-25oC较为合适。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速率增加，所需时间会相应减少，16oC下最常用的连接时间为12-16h。转化体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，热击法和电穿孔法是常用的人工转化的方法热击法：CaCl2诱导的大肠杆菌制备感受态细胞，CaCl2诱导的大肠杆菌转化的原理是将处于对数生长期的细菌置于0°C,CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，同时钙离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加ADNA，钙离子又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。42C热击处理90S，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内，在不含抗生素的培养基中至少培养1h,使受损伤的细胞复苏，转化细胞产生足够的抗性蛋白，便于在含有抗生素的平板上长出抗性菌落。电穿孔法：对制备好的感受态细胞，在电场作用下，细胞膜产生孔洞，使外源）NA分子直接通过微孔，进入细胞。近补筛选法利用8-半乳糖苷酶筛选系统，跟据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。载体上插入了8-半乳糖苷酶的调控序列和8-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，而其对应的宿主菌染色体上整合有8-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入相应宿主菌后，通过a互补作用，形成完整的8-半乳糖苷酶。在加有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上，不含质粒pUC19的E.coliDH5a无法生长；含有质粒pUC19的E.coliDH5a利用8-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，菌落变为红色；含有重组质粒的E.coliDH5a具有氨苄青霉素抗性可以生长，但质BpUC19中有外源基因插入到多克隆位点，使8-半乳糖苷酶N端的基因不能表达，无法实现a互补作用，所以其菌落为白色。转化子的筛选与验证重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或二种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体理解后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或二种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。三、【实验试剂与器材】菌株：E.coliDH5a培养基：LB培养基、麦康凯培养基试剂材料：氨苄青霉素、酶切Buffer、HindIII、ddH2O.连接buffer.T4DNA连接酶、0.1MCaCl2、OMEGA公司的质粒提取试剂盒（含有RnaseA的溶液I，溶液II，溶液I，HBbuffer,DNAwashingbuffer，Elutionbuffer）、琼脂糖，TAE缓冲液、上样缓冲液，EB染液仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖，1.5ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，培养皿，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳仪四、【实验步骤】准备实验准备10ul、200ul、1ml枪尖各一盒灭菌，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中灭菌，牙签若干灭菌，无菌水，配制LB液体培养基，分装至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，灭菌；配制1.2%琼脂的LB固体培养基150ml于300ml的三角瓶中。另配麦康凯培养基250ml于500ml的三角瓶中，灭菌；准备3-4支试管，灭菌；培养皿18个；酶切及酶切产物的验证（1）酶切在冰上按照表一依次把ddH2O、10XMbuffer、DNA、HindIII加入到1.5ml无菌Ep管中。每管样品混合均匀后，4000rpm离心1min，将液体集中于管底。将反应体系放在37oC水浴锅中1-2h。表一限制性内切酶反应体系加样顺序反应体系成分IIIIIIpUC19（各组）久DNA（商品）pUC19（商品）1ddHO/ul213.070.064.0210XMbuffer/ul2.010.08.03DNA/ul4.015.04.04HindIII/ul1.05.04.0总体积/ul20.0100.080.0备注各组一份全班一份全班一份（2）酶切产物的验证-酶切产物琼脂糖凝胶电泳配制缓冲液：将50XTAE稀释至1XTAE缓冲液制胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40皿11XTAE制成1%琼脂糖凝胶。微波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60r左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm，准备上样。上样：取8.0u1酶切反应液、2.0u110Xloadingbuffer混匀，在加样孔上方1-2mm处垂直点样，同时点样1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ul入/HindIII、1.0ul10Xloadingbuffer和100ng入DNA、1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ul入/HindIII（Test）、1.0ul10Xloadingbuffer和100ngpUC19（商品）、1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ulpUC19（商品）/HIIIo表二酶切产物琼脂糖凝胶电泳点样顺序泳道12345617加入的物质入/HIII入DNA入/HindIII（Test）pUC19（商品）、pUC19（商品）/HindIII第一组酶切反应液第十二组酶切反应液样品量4.0ul100ng4.0ul100ng4.0ul8.0ul8.0ul8.0ul10Xloadingbuffer1.0ul1.0ul1.0ul1.0ul1.0ul2.0ul2.0ul2.0ul点样量5.0ul5.0ul5.0ul10.0ul10.0ul10.0ul电泳（实际时间根据电泳条带的迁移情况判断）。染色及观察电泳完成后，将胶放入0.5ug/ml的EB染液中染色约10min，水洗，在凝胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。连接在冰上按照表三依次把ddH）、10xT4连接酶Buffer、pUC19/HindIII、入/HindIII、T4DNA连接酶加入到1.5ulEp管中（我们组分别做了老师提供的质粒和自己的质粒酶切后的连接）。将样品混匀，然后4000rpm离心1min，将液体集中于管底。将反应体系放入16oC水浴锅中连接过夜。表三连接反应体系加样顺序成分体积(〃l)1ddHO23.2210xT4连接酶Buffer1.03pUC19/HindIII1.5-2.04入/HindIII3.5-3.05T4DNA连接酶0.8总体积/ul10.0感受态细胞的制备及质粒转化（1）感受态细胞的制备从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5a单菌落于5mLLB液体培养基里，37°C振荡培养过夜。以1%的接种量将过夜培养的E.coliDH5a接种于新鲜的20mLLB培养基中，37C振荡培养2—3小时后冰浴。分别取1.5mL菌液于2个无菌的1.5mL离心管中，4C，4000rpm离心5min，收集菌体。重复上述操作，使每个离心管中收集3mL培养液的菌体。残留液体漩涡振荡使菌体混匀。每支离心管中加入用冰预冷的100mmol/LCaCl2800ul，轻轻悬浮细胞，冰上放置10min，4000rpm离心5min。弃上清液，加入100ul预冷的100mmol/LCaCl2溶液，用1ml移液枪吹吸轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，即为感受态细胞。将上述2管制备的感受态细胞分装到4个离心管中，每管50ul。（2）质粒转化①取制备好的摇匀后的,4管感受态细胞悬液，I号加入老师提供的酶切质粒的连接产物5.0ul,II号加1.0〃LpUC19（自提），III号不再加物质，IV加入自己质粒酶切的连接产物将以上各管轻轻摇匀。冰上放置10min。在42^水浴中热击90s,然后迅速置于冰上冷却5min。向上述4管中分别加入900ul新鲜的无菌LB液体培养基，摇匀，37°C孵育1h,使受体菌恢复正常生长状态。（3）稀释和涂布平板取准备的麦康凯培养基，冷却至55-60C左右加入氨苄青霉素，另准备1个不加氨苄青霉素的平板。涂布平板I号:实验组一（老师提供的酶切质粒连接产物的转化）：取50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基，每个梯度涂二个。IV号：实验组二（为自提质粒酶切后连接产物的转化）：由于培养基不够，所以我们组选了100ul、200ul各涂布了一个II号：转化对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基。III号：细胞对照组：分别取50ul受体菌液涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基。当菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37C恒温培养约24-26h，观察菌落生长情况并记录是否生长、菌落的数量、培养的颜色等现象。4.重组子的筛选与验证取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板，在底部划线分成4个区域。从实验组一平板上分别选取个3个单个的白色转化子菌落，用接种环划线转接到上述3个区域，编号为1,2,3,实验组二平板上取一个单个的白色转化子菌落，用接种环划线转接到上述第4个区域，编号为4，37C培养过夜。在划线的1,2,3单菌落中选取2个白色菌落，用牙签分别转接到5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，编号为4-1,4-2。编号为从4中选取一个白色菌落用牙签转接到到5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，编号为4-3,37C振荡培养12-16h。分别取4-1和4-3菌液，用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒。1）分别取1.5mL菌液于2个无菌的1.5mL离心管中，室温下，10000rpm离心1min，收集细菌。2）倒弃培养基，重复步骤1一次。3）倒弃培养基，加入250ulSolutionI/RNaseA混合液，涡旋震荡使细胞完全悬浮。4）往重悬混合液中加入250ulSolutionII，轻轻颠倒混匀4-6次，这步要避免剧烈混匀，且反应时间不要超过5min.5）加入350ulSolutionIII，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。6）室温下，13000rpm离心10min.7）转移上清液至套有2ml收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，10000rpm离心1min，倒去收集管中的滤液。8）把柱子重新装回收集管，加入500ulHBBuffer，10000rpm离心1min，弃去滤液。9）把柱子重新装回收集管，加入700ulDNAWashBuffer，13000rpm离心1min，弃去滤液。10）弃去滤液，重复步骤9一次11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000rpm离心2min以甩干柱子基质。12）把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50ulElutionBuffer到柱子基质中，放置1-2min，10000rpm离心1min洗脱出DNA.13）把离心管中离心后的液体重新加到柱子基质中，10000rpm离心1min洗脱。重组质粒琼脂糖凝胶电泳1）配制缓冲液：将50XTAE稀释至1XTAE缓冲液2）制胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml1XTAE制成1%琼脂糖凝胶。微波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60r左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm，准备上样。3）上样：取2plddH2O,2pl质粒，1plloadingbuffer混匀，在加样孔上方1-2mm处垂直点样，同时点样6ul超螺旋marker，100ngpUC19。4）电泳（实际时间根据电泳条带的迁移情况判断）。5）染色及观察电泳完成后，将胶放入0.5ug/ml的EB染液中染色约10min，水洗，在凝胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。五、【实验结果】实验数据

表四实验数据实验步骤物质量连接反应pUC19/HindIII（ul）2.0入/HindIII（ul）3.5试剂盒提取质粒ElutionBuffer（ul）35酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测1234567891011121314151617图一：酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果泳道1为入/HindIII，泳道2为入DNA，泳道3为入/HindIII（Test），泳道4为pUC19（商品），泳道5为pUC19（商品）/HindIII，泳道9为我们组（四组）的酶切产物。分析：从泳道9中我们可以看到两条比较亮的条带，在两条比较亮的条带上面有两条很暗很弱的条带，应该是未除尽的染色体DNA，两条亮带中靠上的一条和泳道5pUC19（商品）/HindIII的电泳图在同一条线上，所以该条带为我们酶切反应预期想要得到的HindIII酶切开的质粒，较亮的条带下方的条带和泳道4pUC19（商品）的电泳条带在同一条线上，为没有酶切开的超螺旋质粒。图谱下方比较宽而且较模糊的条带应该是提取质粒时没有除净的RNA。从图中我们可以看到没有切开的质粒占有很大的比例，如果用该酶切产物继续下一步的连接反应，效果不会很理想，所以我们连接反应做了两组，一组为老师提供的pUC19/HindIII（商品），一组为我们酶切的质粒。

重组子筛选结果表五重组子的筛选涂布平板结果记录\项目组别培养基涂布的转化液的量/ul菌落特征红色菌落数量白色菌落数量菌落总数量培养基颜色培养基pHI号：实验组一（用的老师提供的商品化酶切质粒做连接）A+50菌落较大，菌落既有红色也有白色10814122红色6.0A+5012112133红色A+100菌落为中等大小，菌落既有红色也有白色26323286红色5.5A+100\\\\\\\\\\\\\红色A+150菌落偏小，既有红色菌落也有白色41133444红色5.5A+150\\红色A+200菌落较小，既有红色菌落也有白色无数红色5.5A+200无数红色

IV号：实验组二（用的我们自己的酶切质粒）A+100菌落中等大小，既有红色菌落也有白色红色5.5A+200菌落中等大小，既有红色菌落也有白色15816174红色II号：转化对昭组八、、^zjlLA+50菌落较小，为红色，表面形成菌膜\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\无数红色III号：细胞对照组A+50无菌落红色A-50菌落全为白色，较小，连成片\\\\\\\\\\\\\\\\\\橙红色7.0分析：质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长，所以长出的菌落都是转化子，质粒PUC19进入E.coliDH5a后，通过a-互补作用，形成完整的［3-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用8-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coliDH5a，没有3-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成。-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。所以实验组菌落既有红色也有白色，转化对照组菌落全为红色，细胞对照组在含氨苄青霉素的麦康凯培养基上不生长，在不含氨苄青霉素的麦康凯培养基上菌落为白色。实验结果如预期所料的一样。从实验结果记录上可以明显的看到涂有重组质粒转化E.coliDH5a的平板上，菌落数量随加入菌液量的增多而增加，其中菌落以红色菌落为主，零星散布有白色小菌落，根据红白菌落的多少，计算了一下重组效率，涂布50ul转化液的平板的重组效率为11.4%，涂布1000ul转化液的平板的重组效率为8.7%，涂布150ul转化液的平板的重组效率为8.0%。转化效率是指外源DNA导入细菌的效率，通常用每微克DNA获得转化体的数量表示。涂布50ul转化液的平板的转化效率大约为1.22X105个/ugDNA,涂布100ul转化液的平板的转化效率大约为1.36X105个/ugDNA,涂布150ul转化液的平板的转化效率大约为2.12X105个/ugDNA,转化效率较低。实验发现细胞对照组不加氨苄青霉素的培养基变为橙红色，其他的培养基仍为红色，是因为麦康凯培养基中含有少量的中性红，而中性红是一种酸碱指示剂，当溶液pH小于6.8时显示红色，pH大于8.0时显示黄色。细胞对照组由于没有转进质粒，无法通过a互补作用分解利用乳糖，不产生乳酸，它是利用其他有机物质，所以由于没有产生酸，培养基称弱碱性，培养基为橙黄色。重组子的电泳检测12345678910111213141516图二：重组子的琼脂糖凝胶电泳结果泳道1和泳道9为超螺旋marker，泳道2为pUC19，泳道3-7和泳道10-16为1-6组的重组质粒。分析：泳道11和泳道12为我们组（四组）的重组子的琼脂糖凝胶电泳检测，超螺旋marker电泳条带自上而下的分子量对应的是2087bp、3049bp、3997bp、5026bp、6122bp、8023bp、10085bp、11849bp，pUC19的分子量为2686bp，ADNA经HindIII酶切后的片段大小有125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp。泳道11为4-1实验组重组子，对应超螺旋marker的条带，该条带在2087bp至3049bp之间，大小大约2800bp，所以该重组子是插入了125bp的片段。泳道12为4-2实验组重组子，对应超螺旋marker的条带，该条带在8023bp至10085bp之间，大小约在9200bp，最有可能是插入了大小为6551bp的片段，也可能是同时插入了4361bp的片段和2322bp的片段，也可能是插入了4361bp的片段和2027bp的片段，也可能是插入了3个2322bp的片段，因为插入的片段总分子量较大，所以可能情况很多，不过插入的片段不论是几个，其总分子质量应该在6500bp左右。六、【注意事项】a.酶切限制性核酸内切酶的酶切反应属于微量操作技术，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入到反应体系中。酶切反应中所用的Ep管，枪尖等必须是新的，经过高温灭菌，操作时打开使用。注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶，加酶前先把前几步加的物质甩到管底，。酶液从冰箱中取出后要放在冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，以致影响酶的活性，取出的酶液应立即加入反应混合液的叶面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后应立即放回冰箱，防止酶的失活。Ep管的盖子要盖紧，防止水浴时水汽进入管内，并且做好标记，防止混淆。酶切反应结束后，装有酶切样品的管盖上有大量的冷凝水，应离心2S，使样品集中于管底，再开盖取样检测，注意防止污染。b.连接在微量操作技术、无菌技术、加样技术等方面加以注意。C感受态细胞的制备和转化感受态细胞必须从纯种开始，要从划线纯化的单菌落开始，进行活化培养，不要使用多次转接或储存在4<C冰箱的培养菌液，因为要保证菌株的纯度和活力。控制细胞的生长状态和密度是转化效率的关键，细胞生长浓度以刚进入对数生长期时为好，细胞浓度不足或过高均会使转化效率下降。用于转化的质粒DNA应是超螺旋状态的DNA。转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用的器材和试剂要经过高温灭菌处理，以防被微生物DNA污染。七、【实验讨论和思考题】从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全？如果酶切完全，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图上结果只有一条条带，且与你点的pUC19/HindIII电泳条带在一条线上，完全没有酶切的质粒处于超螺旋状态，因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带，如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在。感受态细胞是什么？感受态细胞是处于