MicroFab的应用：对哺乳动物细胞按需喷墨实现细胞级精度生物打印

———MicroFab的应用：对哺乳动物细胞按需喷墨实现细胞级精度生物打印

浦项科技大学相关研究人员通过MicroFab的JetlabⅡ喷墨打印系统对哺乳动物细胞进行了按需喷墨（DOD）的微阵列打印，并采用MicroFab的30m、50m和80m喷头搭建了微液滴发生装置，进行了对喷射的哺乳动物细胞液滴的观测和研究。喷墨打印后的细胞存活率与未打印的对照组一致。

介绍

活细胞和生物材料的直接打印，也称为"生物打印'，为组织工程和再生医学打开了新的大门，代表了传统的基于预成型支架的组织工程的突破。鉴于生物打印能够将细胞和生物材料放置在具有适当细胞组成和密度的预定位置，2D细胞图案或3D结构的制造取得了巨大进展，例如皮肤、耳朵、软骨等。除了简单或薄的结构之外，还出现了对通过准确和精确的细胞打印来模拟天然复杂和厚的器官在天然组织长度尺度（10m~100m）上具有异质性的正常功能但高度复杂、分层和分层结构的需求。复杂的血管网络也需要细胞级精度。这些活组织和器官在组织学上是涉及细胞外基质蛋白的多细胞构建体，它们各自的功能可以通过微环境表达，微环境对3D空间中这些组件之间的相互作用很敏感。因此，稳定可靠地控制3D空间中细胞和生物材料的空间位置和排列对于高分辨率至关重要，该分辨率几乎等于生物结构和功能组织的微观组织结构。

为确保生物打印能够形成精心设计的架构，已推出各种类型的打印机，例如按需喷墨（DOD）、微挤压、激光辅助和电流体动力（EHD）等。在这些生物打印技术中，DOD喷墨打印已被证明是一种有前途的方法，可根据需要精确沉积受控体积的载有细胞的液滴。鉴于需要精确微小液滴沉积的空间浓度梯度在生物技术中发挥着关键作用，例如在工程微环境中，已通过使用30m喷头打印生长因子的空间浓度梯度来探索固定生长因子上的细胞行为。在合成细菌细胞间多细胞相互作用的研究中，也已使用21.5m喷头打印约2m长的荧光蛋白和大肠杆菌的浓度梯度。此外，单个细胞的随机或自动喷射可以在具有所需细胞密度的3D空间中引发带状组织。

然而，高分辨率或微小液滴体积的名声已被普遍采用的大直径喷头所削弱，为了实现直径范围为15~20m的哺乳动物细胞的高分辨率打印，具体情况见表一a细胞活力通过对照正常化或与对照进行比较。

在这项工作中，研究团队使用了一个MicroFab的30m喷头打印NIH/3T3和HEK293A细胞，目的是实现细胞级精度，并研究打印过程。在评估了NIH/3T3细胞生物墨水的流体特性（例如剪切粘度和动态表面张力）后，研究人员使用高速成像技术分析了喷头内的细胞运动和射流形成。使用用于形成无卫星单滴的优化打印条件，将一系列细胞打印到玻璃基板上，以计算打印的皮升液滴输送的细胞数量。此外，系统地研究了细胞浓度、不同大小的细胞类型和喷头直径对细胞数分布的影响。最后，用live/dead和CCK-8测定以及显微镜观察检查了印后细胞活力、增殖和形态学细胞特征。

实验设备

用于高速可视化皮升液滴的自制喷墨打印设备，如下图所示。▲细胞打印和单闪频闪成像装置示意图。生物墨水通过喷头直径为30m的MicroFab压电喷头喷射。

MicroFab的压电打印喷头能产生满足要求的皮升级微液滴。采用喷头孔径分别为30m、50m和80m。从数据采集板的模拟输出端口生成两个模拟波形。驱动波形由MicroFab的CT-M3-04电压脉冲控制器生成。驱动波形用的脉冲持续时间和电压控制幅度分别为40s~61s和30V~68V。放大后，脉冲被施加到喷头中的压电换能器以喷射液滴。另一个模拟脉冲被发送到一个高分辨率、每像素0.74m的CCD相机和一个持续时间非常短的纳米闪光灯（150ns）通过用于单次闪光高速摄影的数字延迟。图像以每秒5-10帧（fps）的速率获取。还通过使用商用高速相机成像以100000fps的记录速率和光纤耦合卤素灯获得了连续高速图像。发射频率设置为50Hz~200Hz。

使用JetlabⅡ喷墨打印系统来计算每个打印液滴中的细胞数。分别用30m、50m和80m口径的喷头打印2023的点阵列。再用30m口径的喷头打印360360的点阵列，用于验证此喷墨技术的稳定性。所有实验均在1000级洁净室进行，以确保环境无尘无菌。▲MicroFab高精度纳米材料沉积喷墨打印系统JetlabⅡ实验结果

喷头内的细胞轨迹

将细胞转移到玻璃毛细管喷头后，在喷射过程中跟踪它们在喷头内的运动。下图显示了用高速相机记录下的细胞向下移动到喷头口的运动过程。喷射频率设置为5Hz，通过使用短持续时间频闪和高分辨率CCD相机获取高质量图像。在不同喷射时间拍摄的高速图像显示，细胞在向下移向喷头孔径时加速，由于风险效应或伯努利原理，喷头孔径逐渐缩小。上图a显示，沿中心的细胞（黄色虚线圆圈）比靠近壁的细胞（红色虚线圆圈）更快地移动到孔径。上图b显示，细胞的移动速度的差异是由喷头中的速度分布引起的，由于壁处没有滑动条件，它被推测为抛物线分布。

此外，细胞迁移是由脉冲压力和重力驱动的。细胞运动不是连续的，但是当压电致动器产生脉冲压力以产生液滴时，细胞会进行去停运动。当喷头启动并分配约10pL的液滴体积时，生物墨水重新填充到孔口，细胞立即移动。一滴喷射后，随着弯液面振荡衰减，细胞略有波动。对于频闪的一个间隔步骤，单元的平均速度和瞬时速度预期分别为Vcell,avg=l/tinterval10m/0.1s=100m/s和Vcell,max=l/tpulse10m/10s=1m/s。相反，虽然储层中的细胞在恒定重力的影响下缓慢沉降，但事实证明，重力对喷头中细胞运动的影响可以忽略不计。基于将细胞视为刚性球体的假设，根据斯托克斯定律，单元的自由沉降速度（Vg）的值为其中g、c、b、a和b分别是重力加速度、细胞和生物墨水的密度、细胞半径和生物墨水在低剪切速率下的动态粘度。该Vg被预测为2.5m每秒，这意味着重力不占主导地位，并且细胞的移动行为与喷射体积密切相关。

单滴形成

下图显示了单次闪光图像，显示在低电压驱动下细胞悬浮液单滴形成的演变。在脉冲持续期间，喷头开始出现喷射头，在施加波形后，喷射韧带变窄，直至最终解体。断裂后，短韧带缩回头部，最终形成稳定的球状水滴并摆动。下图b表明稳定打印保持在约1.3105滴。通过使用X-Y移动台，将单个液滴图案化到玻璃基板上，液滴间距为120m。单滴形成对于确保稳定和可重复的细胞打印至关重要。通常，细胞以不规则的方式影响射流的形态。特别是在长韧带的情况下，喷射韧带（包括细胞）的形态是异常的，因为与变薄的韧带相比，细胞的直径更大。但是，如果细胞位于主头部，则形态稳定且规则，与没有细胞的射流形态无法区分。射流形态和打印性能（例如，液滴直径和速度）可以通过输入波形的形状进行调制。

通过之前的实验进行分析。最终结果表明，与常用的较大喷头直径相比，30m的小喷头直径可以实现更高百分比的单细胞打印。

细胞活力和增殖

使用live/dead测定法测定打印后立即存活率、CCK-8测定法测定细胞生长率和Hoechst33342染色测定细胞形态，研究通过小喷头喷射对细胞活力和增殖的影响。首先，下图a通过基于live/dead检测试剂盒自动分析绿色和红色染色的细胞群来显示细胞活力。作为对照，移液到孔中的细胞的存活率为96.2%，从30m和80m喷头喷射的细胞的存活率分别为94.4%和96.3%。这种高存活率与先前关于使用较大喷头尺寸的基于喷墨的细胞打印的研究报告的结果一致。接下来，进行CCK-8测定以研究在达到平台期之前的7天小喷头直径是否影响细胞的体外增殖。尽管由于最初接种的细胞数（数据未显示），每组之间的细胞数有所不同，但这些细胞培养组显示出与上图b中代表细胞生长速率的曲线斜率相同的细胞生长趋势。基于采用自然生长规律的简单细胞群模型，表示为

P(t)=P0ekt,

其中t、P0和k分别代表培养时间（天）、初始种群和（人均）增长率；每个组中的细胞在第1天以与每个初始群体相似的增长率呈指数增长。最后，进行细胞形态学检查以进行定性分析。如上图c所示，未观察到明显的形态异常和DNA断裂；此外，这些打印的细胞仍然保持良好的对基材的粘附能力。这些结果表明，30m喷墨喷头对打印的哺乳动物细胞的影响和损害可以忽略不计。实验结论

研究团队展示了基于DOD喷墨的细胞打印，30m喷头可实现细胞级精度。高速成像技术表明，喷头内的细胞在压电致动器产生的脉冲压力下在喷头内进行往复运动。在评估了载有细胞的生物墨水的流体特性后，优化了打印条件以生成没有卫星的载有细胞的单滴。结果表明，液滴中的细胞数量受喷头尺寸（30、50和80m）和细胞浓度（2.5106个细胞/ml和5.0106个细胞/ml）的影响很大，而打印不同的细胞类型在数量上几乎没有变化。30m喷墨喷头能够在5.0106个细胞/ml的细胞浓度下平均每滴打印1.3个哺乳动物细胞。更大的喷头允许更多的细胞通过。分别使用live/dead检测试剂盒、CCK-8检测和细胞形态成像检测细胞的活力、增殖和形态。研究团队发现用非常小的喷头打印后的细胞存活率与未打印的对照一致。喷墨打印非常适合活细胞的沉积，因为它专为精确沉积皮升体积的载有细胞的液滴而设计。此外，使用一个30m喷头可以帮助最大化喷墨技术，以细胞级精度精确沉积生物墨水。资料来源：[1]KimYK,Par