金莲花种质遗传多样性的aflp分析

金莲花种质遗传多样性的AFLP分析摘要：金莲花是我国常用中药材品种，开展种质遗传多样性研究对新品种选育具有重要意义。本文利用AFLP标记技术对8份金莲花种质在基因组水平开展了遗传多样性分析，用POPGENE和NTSYS软件对统计结果进行遗传和聚类分析。从64对AFLP引物组合中筛选出的8对引物组合能够区分全部供试金莲花种质；研究结果表明，地理位置较近的金莲花种质，遗传相似系数较高；引种可造成金莲花种质的遗传结构发生变异。关键词：AFLP金莲花遗传多样性金莲花（TrolliuschinensisBge.），别名金梅草，金疙瘩，为毛茛科多年生植物，以花入药[1]。金莲花含有生物碱、黄酮甙、香豆素、挥发油、甾醇等药用成分，具有清热解毒、滋阴降火、养阴清热、消火杀菌等功效[2~3]，除药用外，还被开发成保健饮品，如金莲花茶等。近年，随着市场需求量的增长，野生金莲花储藏量逐年递减，金莲花野生资源受到严重威胁。尽管有少数金莲花品种已有在平原地区成功引种栽培的报道[4]，但绝大部分野生金莲花种质仍处于濒危状态。丰富的种质资源遗传多样性是金莲花育种的前提和先决条件，金莲花野生种质消亡不仅极大影响金莲花优良品种的选育，还将导致金莲花对环境适应能力的降低，不利于金莲花种群的生息繁衍。开展不同产地野生及栽培金莲花种群的遗传多样性研究，对探讨金莲花濒危机制、建立合理的金莲花种质资源保护策略以及金莲花优良品种选育等具有重要意义[5]。本文对采自河北、山西、北京郊区以及药用植物研究所引种栽培的8份金莲花种质开展了AFLP遗传多样性分析，研究了不同地理位置金莲花种质的遗传差异以及引种对金莲花种质遗传结构的影响，为今后开展金莲花种质资源保护及新品种选育提供了参考依据。一、材料与方法1.植物材料供试材料为不同产地采集的8份金莲花种质（表1），采回种子播种于中国医学科学院药用植物研究所试验田。苗期用健康、幼嫩的金莲花叶片提取基因组DNA，每份金莲花种质提取30个单株。表1供试金莲花材料编号采集地点种质名称生存状态备注B河北东灵山T.chinensis野生——D山西庞泉沟T.chinensis野生——C北京雾灵山T.chinensis野生——X河北围场T.chinensis栽培——G河北围场T.chinensis野生——S河北五岳寨T.chinensis野生——W北京栽培T.chinensis野生采自雾灵山T北京栽培T.chinensis栽培采自河北五岳寨2.AFLP分析（1）模板DNA的制备。称取0.2g金莲花新鲜叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国生物科技）提取金莲花基因组DNA。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度和完整性，根据标准的λDNA浓度将提取的金莲花基因组DNA统一稀释为50ng‧（2）酶切和连接。反应体系为20ul，包括：模板DNA（50ng‧μL-1）4μL；MseI接头（50pmol‧L-1）和EcoRI接头（50pmol‧L-1）各1μL；EcoRI和MseI内切酶（10U‧μL-1）各2μL；10×PCR缓冲液2.5μL；ATP（10mmol‧L-1）2.5μL；T4连接酶（3U‧μL-1）1μL；用ddH2O补足20μL。样品混匀后在37℃保温5h，72℃温浴15min终止连接反应。取5μL连接产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切连接是否成功，剩余反应物-（3）预扩增和选择性扩增。预扩增反应体系为25uL，包括：模板DNA2μL；预扩增引物（50ng‧μL-1）各1μL；dNTPs（2.5mmol‧L-1）1μL；10×PCR缓冲液2.5μL；TaqDNA聚合酶（3U‧μL-1）0.5μL，最后用ddH2O补足25uL。预扩增程序为：94℃2min；94℃30s，56℃30s，72℃80s，30个循环；72℃延伸5min。将预扩增产物用1×TE稀释20倍后作为选择性扩增的模板DNA。选择性扩增体系为25μL，包括：稀释后的模板DNA2μL；10×PCR缓冲液2.5μL；dNTPs（2.5mmol‧L-1）0.5μL；EcoRI和MseI引物（50ng‧μL-1）各1μL；TaqDNA聚合酶（3U‧μL-1）0.5μL；最后用ddH2O补足25uL。选择性扩增程序为：94℃30s，65℃30s，72℃80s，12个循环，退火温度下降0.7℃/循环；94℃30s，55℃30s，72℃80s，23个循环；最后，72℃表2用于AFLP分析的MseI引物和EcoRI引物名称核苷酸序列名称核苷酸序列EcoRI接头15’-CTCGTAGACTGCGTACCMseI接头15’-GACGATGAGTCCTGAGEcoRI接头25’-AATTGGTACGCAGTCTACMseI接头25’-TACTCAGGACTCATEA5’-GACTGCGTACCAATTCA-MC5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-EAAC5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-MCAA5'-GATGAGTCCTGAGTAACAA-EAAG5’-GACTGCGTACCAATTCAAG-MCAC5'-GATGAGTCCTGAGTAACAC-EAGG5’-GACTGCGTACCAATTCAGG-MCAG5'-GATGAGTCCTGAGTAACAG-EACT5’-GACTGCGTACCAATTCACT-MCAT5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-EACC5’-GACTGCGTACCAATTCACC-MCTA5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-EACG5’-GACTGCGTACCAATTCACG-MCTC5'-GATGAGTCCTGAGTAACTC-EAGC5’-GACTGCGTACCAATTCAGC-MCTG5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-EACA5’-GACTGCGTACCAATTCACA-MCTT5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT-（4）电泳结果统计及数据分析。取1μL扩增产物，在PRISM377型测序仪（ABI，USA）上经4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2.4h，GeneScan3.1软件扫描凝胶图片，按照无带记为“0”，有带记为“1”的方法统计清晰、可辨的AFLP扩增条带，最终获得由“0”和“1”表示的数据阵列。用POPGENE1.32软件计算多态位点百分率（PPL）、观察等位基因数（Na）、Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），用于估计金莲花种群内及种群间的遗传多样性。用NTSYS-PC2.11F软件中的SimilarityQualitative命令求得DICE相似系数矩阵，用SANH中的非加权平均数（UnweightPair-GroupMethodusingarithmeticAverages，UPGMA）法对统计数据进行聚类分析，并最终由Treeplot命令生成聚类图二、结果与分析1.金莲花种质的AFLP分析经0.8%琼脂糖凝胶检测，用试剂盒提取的金莲花基因组DNA条带清晰、明亮，而且没有明显的降解。金莲花基因组DNA经EcoRI和MseI双酶切及预扩增，从64对AFLP引物组合中筛选出8对扩增结果稳定、条带清晰、多态性高的AFLP引物组合，即：EACG/MCAC、EAGG/MCAC、EAGC/MCAG、EAGG/MCAG、EAGG/MCTA、EAGG/MCTC、EACC/MCTG和EAGC/MCTT。引物组合EACG/MCAC对部分金莲花种质的AFLP分析结果如图1所示。图1AFLP引物组合EACG/MCAC对金莲花种质的扩增结果金莲花种质遗传多样性分析结果显示，8份金莲花种质的金莲花的平均多态位点百分率为45.93%，平均观察等位基因数为1.4619，平均有效等位基因数为1.2381，平均Nei’s基因多样性指数为0.1424，平均Shannon信息指数为0.2178。就不同金莲花种质而言，多态位点百分率最大值为51.15%，最小值为40.11%；有效等位基因数最大值为1.2680，最小值为1.2050；Nei’s基因多样性指数最大值为0.1590，最小值为0.1230；Shannon信息指数最大值为0.2416，最小值为0.1885（表3）。根据对不同金莲花种质的AFLP分析结果，供试金莲花种质间的遗传多样性偏低。表3金莲花种质资源的遗传多样性分析种质多态位点百分率（%）观察等位基因数有效等位基因数Nei’s基因多样性指数Shannon信息指数D51.151.51161.24460.14900.2308B40.111.40111.20500.12300.1885C45.141.45141.24190.14340.2181X49.601.49601.26800.15900.2416G45.661.45661.24530.14600.2219S49.541.49541.25580.15340.2347W40.971.40971.20710.12370.1896T45.261.47341.23690.14180.2174合计45.931.46191.23810.14240.21782.金莲花遗传距离及聚类分析用NTSYSpc-2.11F软件对8份不同产地的金莲花种质进行遗传分析，获得了基于遗传相似性的聚类图（图2）。在阈值0.77处可将供试金莲花种质划分为四个类群：类群Ⅰ包括种质D、种质X、种质G和种质B。其中，种质X和种质G均来自河北围场，遗传相似系数较高；该组的种质B和种质D具有较近的地理位置，遗传相似系数也较高。类群Ⅱ包括种质C和种质W，均来自北京的雾灵山，种质C为野生种，种质W也是野生种，但在平原栽培过程中，因自然杂交种质W的遗传结构已经发生变化；类群Ⅲ和类群Ⅳ分别仅含种质S和种质T，均来自河北的五岳寨，但种质T经平原栽培后，遗传结构也发生了改变。图2金莲花不同种质的相似系数聚类分析图三、讨论AFLP是Zabeau等[6]发明的一种基于PCR扩增和分子杂交的分子标记技术。AFLP标记技术具有条带丰富、结果稳定等优点，被广泛应用于分子标记、遗传多样性、品种鉴定等研究[7~8]。本试验用AFLP方法对不同地区的8份金莲花种质开展了遗传多样性研究，试验结果表明，AFLP能够稳定、高效地扩增金莲花基因组DNA，对不同产地的金莲花种质能够有效区分，是开展金莲花遗传多样性研究的理想工具。根据对8份金莲花材料的聚类分析结果，山西庞泉沟、河北东灵山和河北围场的金莲花种质聚为一类，推测可能与它们所处的地理位置接近有关。北京雾灵山和北京栽培（原产雾灵山）的金莲花种质聚为一类，说明北京栽培（原产雾灵山）的金莲花种质遗传结构未发生显著变化。河北五岳寨和北京栽培（原产五岳寨）金莲花种质聚类分析结果却恰恰相反，说明北京栽培（原产五岳寨）的金莲花种质遗传结构在引种后发生了明显改变。参考文献中国医学科学院药用植物资源开发研究所主编.中国药用植物资源栽培学.北京：农业出版社，1991.丁万隆，陈震，陈君.金莲花属药用植物资源及利用.中国野生植物资源，2021，22(6)∶19~21.朱殿龙，丁万隆，陈士林，等.金莲花属植物的研究进展.世界科学技术-中医药现代化，2021，8(4)∶26~33.丁万隆，陈震，陈君，等.北京平原地区金莲花引种栽培研究.中草药，2021，34(10)∶附1~附4.李勇，丁万隆.我国部分金莲花种质资源遗传多样性的RAPD研究.植物遗传资源学报，2021，10(4)∶535~539.ZabeauM,VosP,Selectiverestrictionfragmentamplification∶ageneralmethodforDNAfingerprinting,EuropeanPatentApplication,PublicationNo.EP0534858,Paris∶EuropeanPatentOffice,1993杜鹃，马小军，李学东.半夏不同种质资源AFLP指纹系谱分析及其应用.中国中药杂志，2021，31(1)∶30~33.ZhangL,HuangBB,KaiGY,etal.AnalysisofintraspecificvariationofChineseCarthamustinctoriusL.usingAFLPmarkers.ActaPharmaceuticaSinica,2021,41(1)∶91~96.StudyongeneticdiversityofTrolliusChinensisgermplasmsbyAFLPLIYong，DINGWan-long，CHENShi-lin(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)ZhuDinglong(DalianInstituteforDrugControl,Dalian,dalian116021,China)Abstract:TrolliuschinensisisoneofthetraditionalherbalmedicineusedinChina,studyonthegeneticvariationofthemhaveimportantsignificanceforbreedingprogram.GeneticdiversityofeightT.chinensisgermplasmswereanalyzedbyAFLP,andPOPGNEandNTSYSsoftwarewereusedforgeneticandphylogeneticanalysisofstatisticdata.Finally,eightoutofsixty-fourAFLPprimercombinationscandistinguishallT.chinensisgermplasmstested.Resultsindicatedthat,T.chinensiswithneargeographicdistancehavinghighergeneticsimilarity,andintroductionmayresultingeneticvariationofthem.Keywords:AFLP；Trolliuschinensis；Geneticdiversity

社会实践报告系别：班级：学号：姓名：作为祖国未来的事业的继承人，我们这些大学生应该及早树立自己的历史责任感，提高自己的社会适应能力。假期的社会实践就是很好的锻炼自己的机会。当下，挣钱早已不是打工的唯一目的，更多的人将其视为参加社会实践、提高自身能力的机会。许多学校也积极鼓励大学生多接触社会、了解社会，一方面可以把学到的理论知识应用到实践中去，提高各方面的能力；另一方面可以积累工作经验对日后的就业大有裨益。进行社会实践，最理想的就是找到与本专业对口单位进行实习，从而提高自己的实战水平，同时可以将课本知识在实践中得到运用，从而更好的指导自己今后的学习。但是作为一名尚未毕业的大学生，由于本身具备的专业知识还十分的有限，所以我选择了打散工作为第一次社会实践的方式。目的在于熟悉社会。就职业本身而言，并无高低贵贱之分，存在即为合理。通过短短几天的打工经历可以让长期处于校园的我们对社会有一种更直观的认识。实践过程：自从走进了大学，就业问题就似乎总是围绕在我们的身边，成了说不完的话题。在现今社会，招聘会上的大字报都总写着“有经验者优先”，可还在校园里面的我们这班学子社会经验又会拥有多少呢？为了拓展自身的知识面，扩大与社会的接触面，增加个人在社会竞争中的经验，锻炼和提高自己的能力，以便在以后毕业后能真正真正走入社会，能够适应国内外的经济形势的变化，并且能够在生活和工作中很好地处理各方面的问题，我开始了我这个假期的社会实践-走进天源休闲餐厅。实践，就是把我们在学校所学的理论知识，运用到客观实际中去，使自己所学的理论知识有用武之地。只学不实践，那么所学的就等于零。理论应该与实践相结合。另一方面，实践可为以后找工作打基础。通过这段时间的实习，学到一些在学校里学不到的东西。因为环境的不同，接触的人与事不同，从中所学的东西自然就不一样了。要学会从实践中学习，从学习中实践。而且在中国的经济飞速发展，又加入了世贸，国内外经济日趋变化，每天都不断有新的东西涌现，在拥有了越来越多的机会的同时，也有了更多的挑战，前天才刚学到的知识可能在今天就已经被淘汰掉了，中国的经济越和外面接轨，对于人才的要求就会越来越高，我们不只要学好学校里所学到的知识，还要不断从生活中，实践中学其他知识，不断地从各方面武装自已，才能在竞争中突出自已，表现自已。在餐厅里,别人一眼就能把我人出是一名正在读书的学生,我问他们为什么,他们总说从我的脸上就能看出来,也许没有经历过社会的人都有我这种不知名遭遇吧!我并没有因为我在他们面前没有经验而退后,我相信我也能做的像他们一样好.我的工作是在那做传菜生,每天9点钟-下午2点再从下午的4点-晚上8:30分上班,虽然时间长了点但,热情而年轻的我并没有丝毫的感到过累,我觉得这是一种激励,明白了人生,感悟了生活,接触了社会,了解了未来.在餐厅里虽然我是以传菜为主,但我不时还要做一些工作以外的事情，有时要做一些清洁的工作，在学校里也许有老师分配说今天做些什么，明天做些什么，但在这里，不一定有人会告诉你这些，你必须自觉地去做，而且要尽自已的努力做到最好，一件工作的效率就会得到别人不同的评价。在学校，只有学习的氛围，毕竟学校是学习的场所，每一个学生都在为取得更高的成绩而努力。而这里是工作的场所，每个人都会为了获得更多的报酬而努力，无论是学习还是工作，都存在着竞争，在竞争中就要不断学习别人先进的地方，也要不断学习别人怎样做人，以提高自已的能力！记得老师曾经说过大学是一个小社会，但我总觉得校园里总少不了那份纯真，那份真诚，尽管是大学高校，学生还终归保持着学生的身份。而走进企业，接触各种各样的客户、同事、上司等等，关系复杂，但我得去面对我从未面对过的一切。记得在我校举行的招聘会上所反映出来的其中一个问题是，学生的实际操作能力与在校理论学习有一定的差距。在这次实践中，这一点我感受很深。在学校，理论的学习很多，而且是多方面的，几乎是面面俱到；而在实际工作中，可能会遇到书本上没学到的，又可能是书本上的知识一点都用不上的情况。或许工作中运用到的只是很简单的问题，只要套公式似的就能完成一项任务。有时候我会埋怨，实际操作这么简单，但为什么书本上的知识让人学得这么吃力呢？这是社会与学校脱轨了吗？也许老师是正确的，虽然大学生生活不像踏入社会，但是总算是社会的一个部分，这是不可否认的事实。但是有时也要感谢老师孜孜不倦地教导，有些问题有了有课堂上地认真消化，有平时作业作补充，我比一部人具有更高的起点，有了更多的知识层面去应付各种工作上的问题，作为一名大学生，应该懂得与社会上各方面的人交往，处理社会上所发生的各方面的事情，这就意味着大学生要注意到社会实践，社会实践必不可少。毕竟，很快我就不再是一名大学生，而是社会中的一分子，要与社会交流，为社会做贡献。只懂得纸上谈兵是远远不及的，以后的人生旅途是漫长的，为了锻炼自己成为一名合格的、对社会有用的人才.很多在学校读书的人都说宁愿出去工作，不愿在校读书；而已在社会的人都宁愿回校读书。我们上学，学习先进的科学知识，为的都是将来走进社会，献出自己的一份力量，我们应该在今天努力掌握专业知识，明天才能更好地为社会服务。实践心得：虽然这次的实践只有短短的几天，而且从事的是比较简单的服务工作，但是通过与各种各样的人接触，还是让我学会了很多道理。首先是明白了守时的重要性。工作和上学是两种完全不同的概念，上学是不迟到很多时候是因为惧怕老师的责怪，而当你走上了工作岗位，这里更多的是由于自己内心的一种责任。这种责任是我学会客服自己的惰性，准时走上自己的岗位。这对我以后的学习生活也是一种鞭策，时刻牢记自己的责任，并努力加强自己的时间观念。其次让我真实的体会到了合作的重要性。虽然我工作的只是小小的一家餐厅，但是从点单到制