TCI 005-2022 高抗性淀粉小麦籽粒中抗性淀粉含量指标和测定方法

ICS67.060CCSB21团标准ICS67.060CCSB21团T/cl005—2022高抗性淀粉小麦籽粒中抗性淀粉含量指标

和测定方法IndexanddeterminationmethodofResistantStarchContentinHigh-resistantStarchwheatvariety2022-2-8实施2022-2-82022-2-8实施T/#$%%5—2%22将o.lmLD-葡萄糖标准储备液（4.2.2,19）和3.omL的GOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖检测试剂盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP试剂）混合。空白溶液制备玻璃试管中加入0.1mL的乙酸钠缓冲液（4.2.2.11）和3.0mL的GOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖检测试剂盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP试齐I」）混合。试液的测定将样品待测液（4.5.1）1500g离心10min,吸取上清液o.iomL置于玻璃试管，加入3.0mLGOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖检测试剂盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP试剂），与D-葡萄糖标准比色液（4.5.2）和空白试剂（4.5.3）一起放入50℃水浴20min后取出，以空白溶液（4.5.3）调零点，在510rlm处测定样品待测液（4.5.1）和D-葡萄糖标准比色液（4.5.2）的吸光度值。4.6结果计算4.6.1试样中抗性淀粉含量以质量分数3（g/100g,以干重计），计算按式（1）、式⑵进行计算。抗性淀粉（g/loog样品）（含量nio%）-xl00xl62O.lxmx1X0x1000（i）抗性淀粉（g/wog样品）（含量＜io%）_/SAxFx10.3x100«1623-O.lxmx18（）71000（2）式中：AA——相对于空白试剂的吸光度值；F——从吸光度值到微克的转换［在GOPOD反应中100MgD-葡萄糖的吸光度值是确定的，F=100（D葡萄糖的微克数）/100MgD-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度］.单位为微克（pg）；m——分析样本的干重=称取样品重量x（100-含水量）/100,单位为毫克（mg）;10.3——含量＜10%样品的最终体积，单位为毫升（mL）;162/180——从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的无结品水-D-葡萄糖的因子，计算结果保留三位有效数字。4.6.2精密度当样品抗性淀粉含量v2g/100g时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。当样品抗性淀粉含量ag/100g时，在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。目次TOC\o"1-5"\h\z前言21范围42规范性引用文件4GB/T1355小麦粉43术语及定义43.1抗'性淀粉Resistantstarch43.2高抗性淀粉小麦Highlyresistantstarchwheat44测定方法5\o"CurrentDocument"原理5\o"CurrentDocument"仪器和设备7\o"CurrentDocument"试样制备7\o"CurrentDocument"分析步骤7结果计算9、/_i—刖百本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。本文件由中国国际科技促进会标准化工作委员会提出。本文件由中国国际科技促进会归口。本文件起草单位：山东华田农业科技有限公司，山东国仓健生物科技有限公司，山东农业大学,解放军总医院普通外科学部，山东天泽泰田种业科技有限公司，济源市农业科学院，山东莱州宏源面粉有限公司，泰安市谷香园食品有限公司。本文件主要起草人：田纪春，邓志英，胥倩，于海霞，彭莉，田磊、王群青，刘振，王西振，王延训，杨明，张丙乾，彭涛，赵善仓，由佳辉,吕民全，谢秀伦。本文件为首次发布，今后将根据高抗性淀粉小麦的社会需求及检测技术发展情况适时修订。引言小麦是世界上最主要的粮食作物之一，全世界半数以上人口以其产品和制品为主要食品。其中淀粉是小麦籽粒中最重要的贮藏物质，根据在小肠的可利用性，分为可消化淀粉和抗性淀粉。抗性淀粉，又称抗酶解淀粉或抗消化淀粉，是在胃和小肠中不能被淀粉有关酶降解为葡萄糖，利于稳定血糖指数(GI),且在肠胃道和结肠中通过菌群发酵产生短链脂肪酸，利于肠蠕动、防止便秘和结肠癌病变的一类功能淀粉，与人类的健康息息相关。前人对小麦抗性淀粉含量进行了研究，发现普通小麦品种中抗性淀粉含量一般为0.3%-2.5%。薛芳等运用EMS诱变技术，创制出抗性淀粉含量高达5.41%的小麦材料。中国农业科学院作物所夏兰琴等利用基因编辑技术敲除郑麦7698Bobwhite的TaS8E//a基因，获得抗性淀粉含量分别高达6.6%和8.7%的突变体。山东农业大学田纪春团队关于抗性淀粉的研究，起始于2005届付蕾博士的论文，以后又有几名博士和硕士进行了种质筛选鉴定，并通过有性杂交和诱变育种，培育出多个高抗性淀粉新品系。使用本文件方法对创制的16份高抗性淀粉小麦品系进行定量检测，筛选出抗性淀粉含量高于5%的突变体材料10份，其中最高为11.8%。但是，到目前为止，国内外至今还没有关于高抗性淀粉小麦品种的抗性淀粉含量指标的定义和规范，也没有提取小麦粉中抗性淀粉的专用标准。因此，本标准将首次提出高抗性淀粉小麦品种的抗性淀粉含量指标和测定方法，有利于培育更好的高抗性淀粉小麦新品种，对提高人民群众生活质量和健康水平，确保我国营养导向型农业的健康发展具有重要的意义。综上所述，研发制定高抗性淀粉小麦籽粒中抗性淀粉含量指标和检测方法对行业发展是十分必要的。高抗性淀粉小麦品种和有利健康的功能食品具有广阔的市场前景和良好的社会效益。高抗性淀粉小麦籽粒中抗性淀粉含量指标和测定方法1范围本文件规定了抗性淀粉和高抗性淀粉小麦的术语、定义、适用范围、抗性淀粉含量指标以及检测方法。本文件适用于小麦种子及制品中抗性淀粉含量的定量测定。企业在制定企业标准时可参照使用，相关机构在选育、审定和应用高抗性淀粉小麦及其制品时可参照使用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB1351小麦GB/T1355小麦粉3术语及定义1抗性淀粉Resistantstarch又称抗酶解淀粉或抗消化淀粉，是指在胃和小肠中不能被淀粉有关酶降解为葡萄糖，利于降低血糖指数（GI）,且在肠胃道和结肠中通过菌群发酵产生短链脂肪酸，利于肠蠕动、防止便秘和结肠癌病变的一类功能淀粉。3.2高抗性淀粉小麦Highlyresistantstarchwheat在生口发育过程中，籽粒中自然产生和积累的抗性淀粉含量占籽粒干重的比例*%的一类小麦品种（系）。4测定方法原理首先用胃蛋白液消化样品，去除蛋白质，然后用a-淀粉酶和淀粉葡萄糖苗酶(AMG)将样品中的非抗性淀粉水解成D-葡萄糖，加入乙醇终止反应。离心上述溶液，底部残留絮状团即为抗性淀粉。将絮状团置于冰水浴中，加入氢氧化钾溶液将其溶解，用AMG将抗性淀粉水解成D-葡萄糖,与葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOPOD)试剂会产生显色反应,形成复合物，在510nm下测定其吸光度值，根据吸光度值与抗性淀粉含量成正比，计算出抗性淀粉含量。试剂和材料421试剂除非另有规定，试剂应使用分析纯试剂。水应符合GB/T6682规定的三级水。氯化钾(KCI)o氢氧化钠(NaOH)。氧化钾(KOH)0二水合氯化钙(CaCI2・2H2。)。叠氮化钠(NaN3)。警告——叠氮化钠为剧毒物品，操作不当可引起爆炸。磷酸二氢钾(KH2Po4)。浓盐酸(HCI)o□来酸(C4HQ4)。苯甲酸(C7H6。2)。4-氨基安替比林(CnH13N3。)。对羟基苯甲酸(C7H6O3)o乙醇(CH3cH2。H)。冰乙酸(CH3coOH)。a-淀粉酶(BiOtOPPed最适温度50℃-70℃f最适PH5.5-7.5,活性大于6000u/mg)o葡萄糖氧化酶。过氧化物酶。胃蛋白酶(BiOtopped1：3000)o淀粉葡萄糖甘酶原液AMG(3300U/mL)：直接购买使用。该溶液在4。(：可保存5年。溶液配制4M氢氧化钠溶液［c(NaOH)=4.0moI/L］:称取160.0g氢氧化钠加适量水溶解定容至1000mLo2M氢氧化钠溶液［C(NaOH)=2.0rnoI/L］:称取80.0g氢氧化钠加适量水溶解后定容至1000mL。氧化钾溶液［C(KOH)=2.0mol/L］:称取112.2g氢氧化钾加适量水溶解后定容至1000mLo该溶液在室温下可保存12个月。盐酸溶液［c(HCI)=0.1mol/L］:量取8.4mL浓盐酸(4.2.1.7)，加适量水并稀释至looomL。盐酸溶液［C(HCI)=2.0mol/L］:量取180.0mL浓盐酸(421.7)，加适量水并稀释至1000mL。氯化钾溶液［c(KCI)=0.1mol/L］:称取7.35g氯化钾，溶于适量水中并定容至looomL。氯化钾盐酸缓液(KCI-HCI0.1moI/L,pH1.5):向氯化钾溶液(4.2.2.6)中加入盐酸溶液调节pH为1.5。苯甲酸溶液［c(C6H5coOH)=0.2%］:称取0.2g苯甲酸溶于适量水并定容至100mL。口来酸钠缓冲液［c(C3H3。3c00Na)=100mmoI/LzpH6.0］:称取23.2g口来酸溶于1600mL水中，用4M氢氧化钠溶液(422.1)调至pH为6.0,然后加入0.6g二水合氯化钙和0.4g叠氮化钠，最后定容至2000mL。该溶液在4℃可保存12个月。乙酸钠缓冲液［c(CH3C00Na)=1.2moI/L,pH3.8］:量取70mL冰乙酸至800mL水中，用4M氢氧化钠溶液(4.221)调至pH为3.8,最后定容至1000mLo该溶液在室温下可保存12个月。乙酸钠缓冲液［c(CH3c00Na)=100mmoI/L,pH4.5］:量取5.8mL冰乙酸至900mL水中，用4M氢氧化钠溶液(422.1)调至pH为4.5,最后定容至1000mLo该溶液可在4。(：保存2个月。乙醇溶液［C(CH3cH2。H)=50%，体积分数］:500mL无水乙醇加水定容至1000mLo该溶液在室温下可保存12个月。胃蛋白酶液(10%W/V):称取10.0g胃蛋白酶溶于盐酸溶液(4.224)中并定容至100mL。淀粉葡萄糖苗酶使用液(300U/mL):吸取2.0mLAMG(4.2.1.19)用口来酸钠缓冲T/#$%%5—2%22液(4.2.2.9)稀释至22mL,分装于聚丙烯塑料管，放于-20。(：保存。a-淀粉酶悬浮液[10mg(30U/mL)+AmG(3U/mL)]:称取1.0ga-淀粉酶溶于100mL口来酸钠缓冲液(4.2.2.9)中，搅拌5mino加入1.0mL淀粉葡萄糖甘酶使用液(4.2.2.14),混匀后，在离心力〉1500g离心10min,取上清液。该溶液现配现用。GOPOD—氨基安替比林储备液：称取136.0g磷酸二氢钾，42.0g氢氧化钠和30.0g对羟基苯甲酸至900mL水中溶解，用盐酸溶液(4.225)或2M氢氧化钠溶液(4.222)调节该溶液的PH至7.4,定容1000mL,加入1.0g叠氮化钠，溶解混匀。该溶液于4。(2可保存3年。GOPOD—氨基安替比林缓冲液：吸取50.00mLGOPOD—氨基安替比林储备液(4.2.2.16)定容至1000mLoGOPOD—氨基安替比林混合液[葡萄糖氧化酶(>12000U/L)+过氧化物酶(>650U/L)+4-氨基安替比林0.4mmoI/L]:称取300mg葡萄糖氧化酶、4mg过氧化物酶和80mg4-氨基安替比林混合，溶于1000mLGOPOD—氨基安替比林缓冲液(4.2.2.17)中。此溶液需避光保存，-2(TC可保存1年。D-葡萄糖标准储备液(1.0g/L):称取1.00gD-葡萄糖(99.5%,无结晶水)至900mL苯甲酸溶液(4.2.2.8)，定容至1000mL。室温下密封保存时间可保5年。材料小麦籽粒。仪器和设备分析天平(±0.0001g)。离心机(3000g)opH计。旋口实验磨。水浴锅。涡旋混匀器。磁力搅拌器。磁力搅拌棒(5mmxismm)。计时器。具有螺旋盖塑料离心试管(15mL)o容量瓶(100mL,200mLz500mL,1L,2L)。温度计[(37±0.1)；(50+0.1)℃]o玻璃试管(16mmxlOOmm)0塑料盒。移液器(200pL,1000pL)o分光光度计(能够设定510nm,10mm路径口度)。试样制备小麦籽粒约50.0g,用旋口磨磨碎，然后过80目筛子，混匀后保存于广口瓶中，密封备用。如制备小麦粉按GB/T1355标准制备。分析步骤451试液制备制备2份平行试液。准确称取干样100mg(i5mg)样品于带螺旋帽试管中，轻轻拍打试管使样品集中在底部。加入20