蛋白质组学优秀公开课

蛋白质组学

Proteomics

参考书目蛋白质组学：理论与方法，钱小红、贺福初主编，科学出版社蛋白质组学：从序列到功能，钱小红主编，科学出版社蛋白质化学与蛋白质组学，夏其昌等主编，科学出版社蛋白质芯片，MarkSchena著，科学出版社教学内容第一章序论第二章蛋白质的基本结构和功能第三章蛋白质组研究方法第四章蛋白质组学研究工具—一维和二维电泳第五章蛋白质组学研究工具—生物质谱技术第一章序论CHAPTER1Introduction功能基因组与蛋白质组基因研究是20世纪生命科学的主线20世纪上半叶，DNA双螺旋结构的提出；20世纪下半叶，“中心法则”的问世；20世纪90年代，全球性基因组计划尤其是人类基因组计划（HGP）的推进。“后基因组时代”（postgenomeera）功能基因组学（functionalgenomics)成为研究的重心，蛋白质组学（proteomics）则是其“中流砥柱”Andnowfor

theproteome(Nature409:747,2001)

Proteomicsingenomeland(Science291:1221,2001)一、基因组计划的成就人类基因组计划（HGP）：“生命登月计划”2001.2.15、16日，国际人类基因组计划与美国Celera公司分别在Nature、Science上公布人类基因组草图截至2002年初，已有至少75种生物的基因组全序列测定完成基因序列数据为生命科学多层次、多分支的研究提供了丰富的宝藏二、基因组计划的局限基因组计划：遗传图、物理图、全序列图真核生物：基因结构复杂；现有基因识别理论与技术发展的严重不足（ORF的确定等）基因调控：时空特异性基因与其编码的蛋白的线性对应关系只存在于新生肽链而不是最终的功能蛋白中基因是遗传信息的源头，但功能性蛋白才是基因功能的执行体三、蛋白质研究技术方法的突破二维电泳（2-DE）：大规模蛋白质的分离大型图像分析系统与软件的发展大规模样品处理系统高压液相色谱分析（HPLC）激光解吸质谱（LID-MS)电喷雾质谱（ESI-MS）肽质量指纹图谱(PMF)与肽序列标签技术(PST)：准确、快速、自动化、大规模一、蛋白质组研究的开端三、蛋白质研究技术与基本路线蛋白质组研究的宗旨－－将组织或细胞所有蛋白质（至少是大部分）分离与鉴定双向电泳（2－DE）：IPG-DALT等图像分析系统：ELSIE4&8、gellabI&II等蛋白质鉴定方法：氨基酸组成分析、序列测定、肽质量指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）、相对分子质量精确测定、高通量分析系统（highthroughputsystem，HTS）与大规模样品处理机器人、新型质谱（massspectrometry，MS）如MALDI-TOF-MS和ESI-MS-MS等数据库设置与检索系统基本路线：样品制备、图像分析、蛋白质成分的分析与鉴定蛋白质成分的分析鉴定：氨基酸分析、肽质量指纹图谱、氨基酸分析与PMF联合、序列标签途径、N端Edman降解蛋白与微量测序、MS微量测序等四、蛋白质组研究的国内外现状1.发展速度与规模研究论文数量上从1995年的1篇，到2001年的859篇参与的国家从1995年的澳大利亚，到97年的美国、丹麦、瑞士等10个国家3.研究范围－－生命科学中一系列热点领域蛋白质：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较基因：功能基因组计划、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析重要生命活动的分子机制：细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调节、物种进化等医药靶分子寻找与分析：新型药物靶分子、肿瘤恶性标志、人体病理介导分子、病原菌毒性成分蛋白质组作图－早期研究的主要领域：超过11种；第一个完整的蛋白质组数据库（YPD）完成，含6021种蛋白蛋白差异显示：用于环境应激、基因突变、病理进程等研究蛋白连锁图：改进双杂交系统，用于蛋白质组相互作用网络的分析4.国内外研究现状国外研究现状（1）蛋白质组学将成为世纪最大战略资源－人类基因争夺战的重要“战场”。蛋白质组学已经成为新世纪生命科学研究的前沿（3）存在的问题方法学上：2-DE-MS的通量、灵敏度和规模化问题；酵母双杂交技术无法快速、高效的获取复杂蛋白质相互作用的多维信息；蛋白质组的生物信息学研究范围与准确率仍需提高学术上：人类组织或细胞的蛋白质组全谱研究则基本未涉及；具体针对任一生物体或组织/细胞开展全方位的蛋白质组相互作用网络的分析鲜有报道人类蛋白质组正式启动2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO），2003.12.15启动两个首批行动计划人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。中国第一次领导重大国际协作计划。人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头，13国47个实验室参加。第三届国际人类蛋白质组大会04.10在北京举行。主题：蛋白质组生命真谛的诠释。五、蛋白质组研究的发展趋势及我国的应对策略1.重大生命活动中蛋白质组的比较研究

选取1～2类重大生命活动（如重大疾病）中几个相继的重要阶段，分别进行蛋白质组作图，进行系统的定性、定量比较，进而对差别蛋白进行鉴定，然后从核酸、蛋白两层次对差别蛋白进行性能分析，从而确定重大生命活动的蛋白质组基础2.1-2种组织/细胞蛋白质组的系统研究

选取1～2种具有重要生物学意义或性状、且我国已完成cDNA大规模测序的组织或细胞，制备其高分辨率蛋白质组图并建立其蛋白质组图数据库，进而联合应用其cDNA大规模测序的数据，规模化研究其蛋白质组成3.蛋白质组的生物信息学研究

蛋白质组成员的序列、结构、功能及定位分类；基于生化途径、遗传网络等，构建蛋白质组功能系统即蛋白连锁图；建立人或其他哺乳动物蛋白质组数据库；高等生物基因组中蛋白质编码基因的识别及算法研究；基因翻译产物的结构、功能预测；基于蛋白质数据库与知识库的知识与规律发现4.蛋白质组分析的支撑技术研究

新型蛋白质结构、功能预测方法及程序；大规模蛋白质相互作用分析技术；蛋白质分析鉴定中新型质谱技术的发展及应用；基于蛋白质序列、结构及蛋白质组数据库的知识与规律发现理论与方法；HIS系统及蛋白质组分析自动操作系统等

原核及简单真核生物的蛋白质组研究流感嗜血杆菌的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究

致病微生物的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究

下一页流感嗜血杆菌的蛋白质组研究

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)是第一个获得基因组全序列的生物。瑞士的一个小组通过2D研究了流感嗜血杆菌的蛋白质组分，在pH3-10的范围内鉴定了约300个蛋白质组分，然后用有两个尿素浓度的麦黄酮胶分离了很难分离到的5-20kDa范围内的蛋白质，还鉴定了其中的80种。另外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后，在pH6-11的范围内又鉴定了102个蛋白质，其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白。

华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌303个蛋白质斑点进行质谱分析，确定了263个蛋白质，其中大部分是外膜蛋白，以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质。另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质。令人惊奇的是，大约22%的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等电点与分子质量，显示它们可能经过了翻译后加工。返回

大肠杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌全部4000多个基因的DNA序列已被测定，人们想到如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联合起来，会得到更多有用的信息。基于此想法,建立蛋白质基因联合数据库，希望籍此来回答以下几方面的问题：A.所有基因编码的产物在双向图谱上的位置；B.各种蛋白质的丰度；C.不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化；D.各种蛋白质在细胞内的定位；E.某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平。

目前，大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版,大约包括1600个蛋白质斑点的数据，其中大约400个蛋白质斑点已与大约350个基因相对应(有些基因可能有多个蛋白质产物)。对于这些蛋白质，这个数据库可以提供基因名称、蛋白质名称、功能范畴、Swiss-prot数据库编号、Ｇenbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及一些生理信息(如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度)。返回

致病微生物的蛋白质组研究

蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研究上。当今，细菌对大多数抗生素都有了抗性，寻找作用于细菌内新的靶子的研究工作已经展开，找到了许多有效的抗菌化合物。但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及其作用机理。有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失活，但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然未知。

双向电泳分析提供了一个有效手段。

例如在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时，对12种作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察，发现其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质，另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质；因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应，并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核糖体水平上。

蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下蛋白质谱的变化。例如作为一种差异显示技术，这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的不同；结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平上有很大差别，这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会出现失败的现象。返回

酿酒酵母的蛋白质组研究

利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早于蛋白质组概念的提出。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组的完成及其蛋白质数据库在互联网上的建立,大大加速了这一工作。最新版的数据库包括6000多页，每页代表一个已知或推测的酵母蛋白。它包含以下几方面的信息：

A.以序列为基础的已知和推测的酵母蛋白的特征信息，如分子质量、等电点、氨基酸组成、多肽片段大小等；B.一些研究得到的关于各种蛋白质在翻译后加工、亚细胞定位、功能分类方面的信息；C.从以往的超过5000篇关于酵母蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能、相互作用、突变表型的信息。借助数据库的有力推动，在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部分得到鉴定。

正在丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱。初步的研究表明，缺失单一基因将导致的结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白质，而是能导致其他一系列蛋白质量的改变。一些蛋白质减少而另一些蛋白质增多，当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致性状改变。

单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全局性的变化。大约20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%则不然，这时机体能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化。这种基因缺失的研究可能会告诉我们一些关于细胞内蛋白质分子间相互“对话”和“作用”的重要信息，如蛋白质间的物理联系(这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物)、信号传递途径，以帮助我们了解细胞是如何构成的以及是如何协同工作的。返回多细胞真核生物的蛋白质组研究

线虫的蛋白质组研究

果蝇的蛋白质组研究

人类的蛋白质组研究

线虫(C.elegans)的蛋白质组研究

利用双向电泳技术，Bini对线虫进行了蛋白质组分析。在等电点3.5-9和分子质量10-200kDa的范围内可分辨2000个以上的蛋白质斑点，然后利用Edman微量测序技术对其中24个斑点进行分析，得到其中12个蛋白质的Ｎ端序列。其余的由于Ｎ端封闭而未能测出序列。

已测出的12个中有1个未能找到与其匹配的基因。另外11个与能量代谢、酸性核蛋白、Ｇ蛋白等对应。

Ｃ.elegans的19000个基因已于1998年12月全部测出，预计会对蛋白质组的研究提供帮助。返回果蝇的蛋白质组研究

不同性别果蝇(Ｄrosophilamelanogaster)成虫的头、胸、腹部的蛋白质组图谱已被分别作出，总共约有1200个蛋白质被检出。其中的大多数在头、胸、腹中是相同的，但也发现了一部分其部位、性别特异的蛋白质。返回人类的蛋白质组研究

人类的蛋白质组研究吸引了最多的注意力。由于人有着大量的组织、细胞类型和发育阶段，对人蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织、细胞和疾病上。已有的证据表明，尽管人的不同组织有着很大的功能差别，但其中的许多蛋白质是看家蛋白，因此它们的双向图谱可能也是近似的。这点与简单生物不同，简单生物在不同的发育阶段有着极不相同的蛋白质组。

因此对于人类来说，一个高质量的基本的双向图谱是非常有用的，它可以作为其他组织、细胞的参照图谱。人的各种组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被广泛研究。人的各种体液（血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等）都被用于研究与某些疾病的关系。

最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的蛋白质与生理状态的关系。他们发现了一种新的蛋白质，这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质。这个发现可能会提供疾病诊治的新的手段。在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现，乙醇会改变血清蛋白糖基化作用，导致许多糖蛋白的糖基缺乏，如转铁蛋白。

肿瘤至今仍是人类的一个顽敌。癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物，而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平。肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所不能提供的早期诊断依据，例如利用不同细胞组织的特征蛋白质谱，可以判别一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源。

丹麦的一个小组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了150例膀胱癌病人的组织，发现在所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现