创新实验开题报告模板

蛇毒腺cDNA文库的筛选小组成员：杨永艳、靳雪英、梁传雯、侯芝娟一、 背景知识cDNA文库是用某一组织细胞中全部的mRNA反转录为cDNA构建而成的，有组织细胞特性及蛋白质基因表达的时空特异性。cDNA文库构建技术已经相当成熟，从cDNA文库中筛选目的基因是研究脏器基因表达谱的有效方法，另外，由于cDNA文库构建时用的原材料是细胞中成熟的mRNA，因此从文库中筛选出来的目的基因不含内含子，可以直接用于基因工程表达，是研究蛋白功能的好方法。自20世纪70年代首例cDNA克隆技术问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的重要手段之一。通过构建cDNA文库不仅可以有利于濒危珍惜生物资源基因的保护，而且可以提供构建分子标记连锁图谱所用的探针，可以用于分离全长基因，进而开展基因功能的研究。因此，cDNA文库在研究特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，因而在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和凋亡调控、肿瘤分子机制等生命现象的研究中具有广泛的应用价值。建立cDNA文库的目的在于分离目的基因，cDNA文库构建完成后，更繁重的任务是cDNA文库的筛选。目前cDNA文库的筛选方法主要有以下几种：（1） 基于核酸探针的分子杂交筛选主要用于已知蛋白部分氨基酸序列的目的基因筛选，是从cDNA文库中选择目的基因最常用、最可靠的方法。适于大规模筛选某蛋白的基因家族，但操作的技术难度相对较大，成本高。（2） 菌落杂交筛选法可以通过在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上原位裂解细菌菌落,再与相应的核酸探针进行杂交的方法进行筛选,该法虽有一定的筛选特异性,但操作中要用到同位素，通量小。（3） 基于抗体的免疫学筛选该方法成功的关键是要提供特定的特异性抗体，并且该方法只能针对目的基因的cDNA按正确读框和方向插入载体的cDNA表达型文库的筛选。如果外源蛋白对宿主菌有毒性，则对应的克隆就无法正常生长，因此用抗体法筛选cDNA文库，前提必须是外源蛋白对宿主菌没有毒性。菌落PCR通常先随机挑取大量候选菌落／克隆进行培养，取小体积菌液离心收菌体，绕过提取质粒DNA,利用在PCR预变性过程中直接释放的质粒DNA作模板,以设计的特异性引物作PCR,然后用琼脂糖凝胶电泳结果中目的基因片段的大小及有无来初步获取候选克隆，再利用测序确定。随机测序通常先随机挑取大量候选菌落／克隆进行培养(如几千个)，提取质粒DNA,然后直接以载体的通用测序引物进行测序,然后从中选取目的克隆用作下一步研究，该方法最大的缺点是成本昂贵。BLASTBLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool) 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。BLAST采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。BLAST的功能BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上发表的方法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对序列也考虑在内了。BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。所查询的序列和调用的数据库则可以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。

BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对二、实验目的与原理实验目的:从蝮蛇毒腺cDNA文库中筛选有较大外源片段插入的克隆作候选阳性克隆,为下一步研究奠定基础。（含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆）实验原理：由于cDNA文库较大，一个个筛选工作量大，采用菌落PCR法可以同时对多个克隆进行初步鉴定，明确克隆体内是否有较大外源cDNA片段，然后可以对阳性克隆做进一步的筛选，提高筛选效率。故本次实验采菌落PCR法进行阳性克隆的筛选。菌落PCR是以文库中随机挑取的菌落克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行扩增,用来鉴定和筛选阳性克隆的技术。Sathe等将含有重组质粒的细菌经过94°C变性1min以后，用倒置显微镜观察，发现大部分细胞破裂，释放出其DNA,因此可将其细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA。菌落PCR技术操作过程简单，时间周期短，高通量，不仅提高了鉴定的效率，而且提高了鉴定的准确性。双脱氧链终止法测序原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在4个反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3'端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。三、材料和方法实验材料及试剂1.1实验材料待筛选的候选克隆，由课题组提供。1.2主要试剂LB培养基100mL配制：Bacto胰蛋白酶（DIFCO）lg,Bact酵母提取物（DIFCO）0.5g,NaCLlg,用1moL/LNaOH调pH至7.2,再补充双蒸水至100mL，高温灭菌。PCR相关试剂TaqDNA聚合酶、PCRMastermix：为Fermentus公司产品，针对不同蛋白家族的特异性引物1、引物2用生物信息学软件设计,由北京奥科生物技术有限公司合成。10mg/mLEB配制：小心称量200mgEB，转移到广口瓶中，加入20mL双蒸水,用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解,用铝箔包裹后,于4°C贮存电泳用琼脂糖凝胶：为美国Ameresco公司产品。点样缓冲液（Loadingbuffer）电泳缓冲液（50XTAE）配制：称242gTris、溶于800mL双蒸水中，加57.1mL冰醋酸和100mL0.5moL/LEDTA（pH8.0）,再加水定容至1L,室温保存备用1.3仪器及其它试剂PCR仪、电泳仪、电泳槽、梳子、凝胶成像系统、低温冰箱、恒温摇床、台式高速离心机、微波炉、超净工作台、微量移液器（100uL、20uL、10uL、2uL）、枪头、电子天平、恒温水浴锅、量筒（100mL）、酒精灯、双蒸水、无菌牙签、Eppendorf管（1.5mL,20个）、无菌试管（15mm*150mm5个）、250mL烧杯、玻璃棒、广口瓶（1个）实验方法

2.1方法菌落PCR法。2.2技术路线（1）准备:各种试剂及器材的准备（见材料与试剂）（2） 摇菌:从文库保存平板上随机挑取5-10个单菌落克隆,分别接种到盛有500此LB液体培养基中（氨苄抗性），然后置于37°C恒温摇床中过夜培养。（3） 裂解菌体:取1.5mLEppendorf管，分别取20yL单克隆培养物分别加至到PCR管中,12000RPM离心1Min，将管中的上清取掉。PCR扩增:PCR反应体系（25uL）:1uL1uL10XPCRMasterMix12.5uL引物1(10umoL/L)1uL10XPCRMasterMix12.5uL引物1(10umoL/L)1uL引物2(10umoL/L)1uL加入一滴矿物油，离心30s.PCR反应条件：预变性：94C5min变性：94C30s"退火:55C30s延伸:72C1-2min最终延伸：72C10min保存:4Coo灭菌去离子水>30个循环9.5uL

9.5uL（5）1%琼脂糖凝胶电泳称量0.5g琼脂糖，转入耐热锥形瓶内，加50mLTBE，用微波炉熔化，然后加2uLEB，混匀。在电泳槽内插入梳子，平放于试验台上，待凝胶冷却到50-60°C后倒入电泳槽。加电泳缓冲液至充分没过凝胶。拔出梳子时应谨慎。取10uL扩增物加入2uL点样缓冲液（Loadingbuffer）,混合均匀。然后小心地加入凝胶点样孔中，旁边加上DNAMarker，然后开始电泳，电泳10-20min，等溴酚蓝跑到凝胶前沿时停止。（6）结果把凝胶放到紫外成像仪下观察，参照DNAmarker和DNA片段所在位置判断PCR产物大小，选择符合预期的克隆用双脱氧链终止法测序。TAGCAACStlAlTdGTPdCl?dHP+dtfriTdA'IltlAlTdGTPdCl?dHP+dtfriTdA'Il1GTP

dCIT+ddCTP

emFdATPdGTP+ddGTPdCI'Pdi[TdA'ir+ddAIPdWjcn1UH?-AlCGIdJI-ATCGddT-AdJT、-AlCGIdJI-ATCGddT-AdJT、-ATcidCAlCGTrddG-ATCcidGddATCGA双脱氧链终止法测序流程图7）生物信息学分析按照候选克隆的测序结果，访问NCBI网站，在线对测序结果作BlastX和blastn比对分析，构建系统进化树，分析蛋白的结构域，为下一步的基因工程表达和功能研究奠定基础。参考文献:请参照新文献1、 J.萨姆布鲁克等•分子克隆实验指南[M].北京:化学工业出版社，2007。2、 张军科.白粉菌诱导的华东葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选[J].中国农业科学,2010。3、 赵巧莲.管圆线虫V期幼虫cDNA文库的构建及免疫学筛选J].中国病原生物学杂志,2010。4、 詹晓娟.三叶因子2相互作用蛋白基因在胃癌细胞cDNA文库中的筛选J].世界华人消化杂志,2009。5、 刘琴.东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2009.6、 李华等.菌落