实验二琼脂糖凝胶电泳实验知识交流

试验二琼脂糖凝胶电泳试验仅供学习与沟通，如有侵权请联系网站删除感谢仅供学习与沟通，如有侵权请联系网站删除感谢2【试验目的】学习琼脂糖凝胶电泳的根本原理；把握使用水平式电泳仪的方法；学习在含有甲醛的凝胶上进展RNA电泳的方法。【试验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程试验室中分别鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为〔pH8.5〕，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由以下几种因素打算：DNA的分子大小。线状双链DNA分子在确定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。一样分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时觉察凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是由于含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上消灭一样的DNADNA。电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强上升引起的2kbDNA片5v/cm。DNA的电泳迁移率。在没有离子存电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中〔如误10×电泳缓冲液〕，则电导很高并明显产热，严峻时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)〔1〕DNA254nm紫外光EB能放射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将浓度的标准样品作电泳对Sybergreen。DNARNA的分别鉴定；但经甲醛进展变性处理的琼脂RNANorthernRNA是单链，其泳动速度与一样DNARNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更结实结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。【试剂与器材】〔一〕材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等〔二〕试剂150TAE(1000mL)：242gTris,57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。3DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油〔w/v〕。4RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mMEDTA(PH8.0)，50%甘油〔w/v〕，DEPC水配制，高压灭菌备用。5、5 醛变性胶电泳缓冲液：0.1mMOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mMEDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。【操作方法】〔一〕常规的水平式琼脂糖电泳可参考下表：琼脂糖的含量〔%〕分别线状DNA分子的有效范围〔Kb〕0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.11x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖溶化,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以削减水份蒸发。胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,1mm左500.5微克/EB(EB参与凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；DNA1X。10μL微量移液器分别将样品参与胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔四周的凝胶面。〔留意：加样前要先登记加样的挨次和点样量〕。4．电泳：加样后的凝胶板马上通电进展电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极〔黑色〕向正极〔红色〕方向移1cm处时，停顿电泳。254nm的紫外灯下观看染色后〔2〕的或已加有之。〔二〕RNA电泳〔选做〕配制23mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mLDEPC水中，冷却至60 C，参与5mL的5x5.5mL30分钟后使用。甲醛变性胶RNA样品的制备：1μLRNA，5 甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加热15min，快速冰浴，加1μL上样缓冲液和0.2μL的EB。步骤：3%30分钟以上。胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。预电泳：110min5V/cm。3-4V/cm。254nm的紫外灯下观看电泳胶板并拍照保存图片。【留意事项与提示】EBEB洒到桌面EB的容器或物品必需经特地处理后才能清洗或丢弃。简洁处理方法为：参与〔0.5mg/mL以下〕，0.25%次磷酸〔由50%0.5mol/L1天后，参与过量的1mol/LEB1/200左右。DNADNA迁移率降低。因此，假设要准确地测定DNA的分子量，应当承受跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。RNARNA28SrRNA、18SrRNAmRNARNA组18SrRNA处为明显的亮带〔4.5kb1.9kb〕，28S/18S1.5-2.5/1；植物、昆RNA0.5-3.0kb28S/18S1/1，或者消灭拖RNA28S18SrRNA大局部已降解，则需重制备。【试验安排】只需一天：上午配试剂倒胶，下午