微生物学设计性实验细菌耐受噬菌体突变率测定课件

1细菌耐受噬菌体突变率的测定

——微生物创新性试验第五组：2

细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。本组设计性实验题目：

测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率3研究背景本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。筛选出优良菌种，以便更好地利用其资源进行研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细菌杀死，从而选择耐受细菌。56研究概述研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来，并繁殖成为优势菌群。研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗及临床用药起辅助性作用。研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的自发突变频率。研究问题：突变率测定实验材料1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。

（建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体，如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌体。）2.LB液体培养基及LB固体培养基。3.试管、培养皿、刻度定量吸管。4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。7实验步骤91.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应的噬菌体原液（噬菌体效价10^10）铜绿假单胞菌的倒置过夜培养物噬菌体原液实验步骤2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数：

CFU数=每个平皿中的CFU数×10×血清稀释倍数102.1110倍连续稀释，至少7管通俗的解释是指每毫升菌液中含有多少单细胞。传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。13实验步骤3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，菌数约为10^9CFU/ml左右。

2~3h后，可见菌液逐步变清，待完全变清（月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一个LB琼脂平板上，置37℃下培养过夜。次日计数CFU。144.耐受噬菌体突变频率的计算第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液中的总菌数。故：

耐受噬菌体突变频率=15第3步中获得的CFU数第2步中获得的CFU数2.分离培养容易本菌生长对营养要求不高。3.生长特点明显该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。（可用以鉴别）4.采用CFU计数的科学性。5.实验现象明显，便于观察。17预期结果18稀释度10-110-2…10-7123平均123平均…123平均CFU数/平板

…

每毫升的CFU数

…

预期结果经相关文献预测：

铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.4×10^-7～7.9×10^-7之间。19思考题(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。21参考文献《微生物学通报》MICROBIOLOGY

国际标准刊号：ISSN0253-2654