抗体制备技术

抗体制备技术第1页，共90页，2023年，2月20日，星期五引言概念抗体(antibody,Ab)是B细胞识别抗原后，增殖、分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性结合。2第2页，共90页，2023年，2月20日，星期五引言结构与类别3第3页，共90页，2023年，2月20日，星期五引言应用领域4第4页，共90页，2023年，2月20日，星期五引言人工抗体制备多克隆抗体（免疫血清）单克隆抗体基因工程抗体5第5页，共90页，2023年，2月20日，星期五引言高质量的抗体应该具有高效价、高特异性及高亲和性。制备高质量抗体就必须有理想的免疫原，适宜的动物和制定最佳的免疫方案。6第6页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备免疫原问题一：多克隆抗体制备第7页，共90页，2023年，2月20日，星期五何谓免疫原？免疫原（immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten）；免疫原包括颗粒性抗原、可溶性抗原和人工修饰的抗原；8第8页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备颗粒性免疫原颗粒性免疫原包括：细胞性抗原：血细胞和组织细胞病原体：细菌、病毒、支原体等9第9页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备绵羊红细胞采集静脉血玻璃珠脱纤维离心、洗涤调合适浓度10第10页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备细菌性免疫原培养细菌分离、鉴定离心、洗涤合适浓度扩大培养灭活处理11第11页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备可溶性免疫原组织匀浆破碎细胞提纯目的蛋白酶消化处理超声粉碎反复冻融12第12页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备可溶性免疫原提纯目的蛋白选择性沉淀凝胶层析离子交换层析亲和层析13第13页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备可溶性免疫原层析技术层析柱紫外监测收集器14第14页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备可溶性免疫原免疫原的鉴定纯度蛋白含量免疫活性分子量15第15页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原人工免疫原经过人工修饰的半抗原称之为人工免疫原。如：甾体类激素、小分子药物等。将半抗原与蛋白载体连接，使之具有免疫原性，可用于制备免疫血清。16第16页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原用于连接的载体蛋白质类：白蛋白多肽聚合物：多聚赖氨酸大分子聚合物：羧甲基纤维素常用：BSA，OA17第17页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原修饰半抗原是需考虑：半抗原的溶解度和稳定性;结合键的位置;选择适合的偶联试剂；18第18页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原含有氨基或羧基的半抗原与载体连接方法：碳化二亚胺法混合酸酐法戊二醛法形成稳定肽键19第19页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原不含有氨基或羧基的半抗原需改造成带有上述基团的衍生物，再通过上述方式连接：琥珀酸酐法可将带有羟基的半抗原改造成带羧基的半抗原。20第20页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备人工免疫原一般情况下：人工免疫原的制备是一个重要和复杂的工作；一种半抗原需同时连接两种不同载体，便于半抗原抗体的检测；21第21页，共90页，2023年，2月20日，星期五关于佐剂的使用何谓“佐剂”佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。22第22页，共90页，2023年，2月20日，星期五关于佐剂的使用佐剂种类：具有免疫原性抗酸杆菌（BCG）无免疫原性福氏佐剂氢氧化铝常用：福氏佐剂23第23页，共90页，2023年，2月20日，星期五福氏佐剂成分：羊毛脂液体石蜡BCG不完全佐剂完全佐剂24第24页，共90页，2023年，2月20日，星期五福氏佐剂使用原则：颗粒性抗原一般情况下不需使用；可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂；不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应；25第25页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备福氏佐剂-可溶性抗原复合物可溶性抗原福氏佐剂充分乳化研磨法与注射器混合法26第26页，共90页，2023年，2月20日，星期五选择动物与免疫动物问题一:免疫血清的制备第27页，共90页，2023年，2月20日，星期五免疫血清与多克隆抗体28第28页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备免疫血清的程序获得理想免疫原选择免疫动物确定免疫方案实施免疫程序检测抗体效价采血分离血清抗体纯化鉴定29第29页，共90页，2023年，2月20日，星期五如何选择免疫动物原则：免疫原与动物种属关系；动物个体状况的选择；抗原性质与动物种类；抗血清用量和要求；30第30页，共90页，2023年，2月20日，星期五如何选择免疫动物家兔是最常用的免疫动物山羊、绵羊马、骆驼31第31页，共90页，2023年，2月20日，星期五动物饲养做好标记细心观察做好记录精心喂养32第32页，共90页，2023年，2月20日，星期五免疫方案免疫原用量免疫途径次数与间隔时间33第33页，共90页，2023年，2月20日，星期五免疫方案之一：全量免疫法足掌皮下接种福氏完全佐剂-抗原（l～10mg）背部皮下接种福氏不完全佐剂-抗原（l～10mg），并重复3-4次，间隔1周肌肉、腹腔或静脉加强免疫（l～10mg）1周1周34第34页，共90页，2023年，2月20日，星期五免疫方案之二：微量免疫法足掌皮下接种BCG（10～20mg）腘窝淋巴结注射福氏完全佐剂-抗原（0.1～0.2mg）肌肉或静脉加强免疫（0.4～0.6mg）1周1周35第35页，共90页，2023年，2月20日，星期五如何测定抗体效价颗粒性抗原免疫原性强，抗体效价高，可采用凝集实验测定。可溶性抗原采用沉淀反应或其它标记免疫技术测定。36第36页，共90页，2023年，2月20日，星期五如何测定抗体效价ELISA是常用技术之一37第37页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备单克隆抗体的理论基础问题二:单克隆抗体制备第38页，共90页，2023年，2月20日，星期五克隆选择学说1857年，FMBurnet提出克隆选择学说。指出：每个B淋巴细胞表面的抗原受体只识别一种抗原表位，并产生针对该决定簇的抗体。39第39页，共90页，2023年，2月20日，星期五克隆选择学说40第40页，共90页，2023年，2月20日，星期五克隆选择学说淋巴细胞不能在体外长期存活41第41页，共90页，2023年，2月20日，星期五杂交瘤技术杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性42第42页，共90页，2023年，2月20日，星期五杂交瘤技术的创始人43第43页，共90页，2023年，2月20日，星期五杂交瘤技术1984荣获诺贝尔生理医学奖杂交瘤技术是制备抗体的技术革命44第44页，共90页，2023年，2月20日，星期五杂交瘤技术的基本原理问题二:单克隆抗体制备第45页，共90页，2023年，2月20日，星期五两个基本问题选择亲本细胞与细胞融合应用选择培基与杂交瘤细胞筛选46第46页，共90页，2023年，2月20日，星期五亲本细胞之一：免疫脾细胞被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆细胞并分泌免疫球蛋白；单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识别并结合一种抗原表位，分泌单一特异性抗体；47第47页，共90页，2023年，2月20日，星期五亲本细胞之一：免疫脾细胞采用BALB/c小鼠48第48页，共90页，2023年，2月20日，星期五亲本细胞之二：骨髓瘤细胞选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株；能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，并分泌免疫球蛋白；骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白；具有较高融合效率；49第49页，共90页，2023年，2月20日，星期五亲本细胞之二：骨髓瘤细胞SP2/0细胞NS1细胞容易培养传代，一般培养基即可，无特殊要求。50第50页，共90页，2023年，2月20日，星期五亲本细胞之二：骨髓瘤细胞Sp2/0为悬浮型细胞51第51页，共90页，2023年，2月20日，星期五细胞融合52第52页，共90页，2023年，2月20日，星期五细胞融合化学法物理法生物法PEG（聚乙二醇）为最常用的融合法53第53页，共90页，2023年，2月20日，星期五选择培养基基本成分次黄嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）HAT选择培养基54第54页，共90页，2023年，2月20日，星期五选择培养基作用原理为何使用选择培养基？55第55页，共90页，2023年，2月20日，星期五选择培养基作用原理56第56页，共90页，2023年，2月20日，星期五选择培养基作用原理57第57页，共90页，2023年，2月20日，星期五杂交瘤技术的实验流程问题二:单克隆抗体制备第58页，共90页，2023年，2月20日，星期五实验流程59第59页，共90页，2023年，2月20日，星期五实验流程60第60页，共90页，2023年，2月20日，星期五实验流程制备免疫脾细胞培养骨髓瘤细胞细胞融合克隆筛选克隆化细胞鉴定大量制备61第61页，共90页，2023年，2月20日，星期五技术要点免疫脾细胞的制备骨髓瘤细胞的培养与筛选细胞融合阳性克隆的筛选克隆化大量抗体的制备62第62页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备脾细胞选择合适的免疫方案是获得高质量的抗体的前提；一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫；免疫方案应根据抗原的特性不同而定；

63第63页，共90页，2023年，2月20日，星期五制备脾细胞64第64页，共90页，2023年，2月20日，星期五培养筛选骨髓瘤细胞SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧失酶的缺陷；为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变；65第65页，共90页，2023年，2月20日，星期五培养筛选骨髓瘤细胞+8-AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells66第66页，共90页，2023年，2月20日，星期五培养筛选骨髓瘤细胞使用对数生长期细胞，融合前进行换液，确保细胞处于最佳状态。培基：RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。67第67页，共90页，2023年，2月20日，星期五细胞融合FUSIONPEGMYELOMACELLSSPLEENCELLSHYBRIDOMACELLSELISAPLATEFeederCellsGrowthMediumHATMediumPlatingofCellsinHATselectiveMediumScanningofViableHybridomas68第68页，共90页，2023年，2月20日，星期五细胞融合杂交瘤技术中最为关键一步；融合前亲本细胞需经预处理；融合37℃水浴中进行；注意两种亲本细胞的比例；选择高质量细胞融合剂；缓慢终止融合作用；69第69页，共90页，2023年，2月20日，星期五关于“PEG”分子量1500-3000道尔顿；诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合；不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同；应用浓度为50%；70第70页，共90页，2023年，2月20日，星期五挑选阳性克隆细胞生长至一定数量后便可进行；方法应敏感、简单、重复性好；方法：

RIA、ELISA、FIA；71第71页，共90页，2023年，2月20日，星期五挑选阳性克隆ELISA是常用技术之一72第72页，共90页，2023年，2月20日，星期五克隆化将阳性克隆与其它克隆分开的过程。克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢失。方法有：显微操作法有限稀释法软琼脂法

73第73页，共90页，2023年，2月20日，星期五应用有限稀释法进行克隆化不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法74第74页，共90页，2023年，2月20日，星期五细胞鉴定特异性Ig类与亚类中和活性染色体核型识别抗原表位亲和力75第75页，共90页，2023年，2月20日，星期五大量制备抗体体外细胞培养腹腔内培养76第76页，共90页，2023年，2月20日，星期五大量制备抗体腹腔内培养77第77页，共90页，2023年，2月20日，星期五实验流程体外细胞培养78第78页，共90页，2023年，2月20日，星期五实验流程注意：阳性细胞克隆的冻存与复