微生物实验器材与基本操作

微生物实验器材与基本操作第1页，共40页，2023年，2月20日，星期四内容实验室的基本设备培养器皿准备培养基的制备灭菌与消毒微生物的无菌操作与检查第2页，共40页，2023年，2月20日，星期四实验室的基本设备玻璃试管

管壁必须较厚，没有翻口接种工具第3页，共40页，2023年，2月20日，星期四培养皿的准备（一）清洗

(清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的重要条件之一）目的：除污垢（灰尘、油污、无机盐）洗涤剂：洗衣粉

洗洁精

第4页，共40页，2023年，2月20日，星期四玻璃仪器的清洗新购买的玻璃器皿的清洗（表面附有游离的碱性物质）比色皿的清洗

不可用强碱，也不可用超声清洗用洗液浸泡，再用自来水冲洗，应内外不挂水珠第5页，共40页，2023年，2月20日，星期四使用过的玻璃器皿的清洗一般玻璃器皿染菌的玻璃器皿121℃高压蒸汽灭菌，20~30min染菌的移液管

使用后立即放入5%石炭酸溶液中浸泡数小时第6页，共40页，2023年，2月20日，星期四塑料器皿的清洗硅胶塞：新购置的硅胶塞带有带量的滑石粉，用自来

水冲洗，再用2%NaOH溶液煮10~20min。再

用自来水冲洗，然后再用5%盐酸溶液浸泡

30min，最后再用自来水冲洗。第7页，共40页，2023年，2月20日，星期四含有琼脂培养基的玻璃器皿用玻璃棒将琼脂培养基刮下琼脂培养基已干燥

将器皿放入少量的水中煮沸，使琼脂熔化后趁热倒出第8页，共40页，2023年，2月20日，星期四洗涤后培养皿的放置第9页，共40页，2023年，2月20日，星期四（二）包扎（1）培养皿的包扎

洗净晾干后的培养皿，用旧报纸包扎，每包6—10套。（2）吸管的包扎第10页，共40页，2023年，2月20日，星期四（3）试管的包扎

塞上合适的试管塞（塞子的1/2~1/3进入试管），然

后7—10支一捆用报纸包扎，灭菌。（4）试剂瓶的包扎

用报纸或牛皮纸包扎后，灭菌。

（5）三角瓶的包扎

塞上合适的试管的塞，或盖上8层纱布，外加一层报

纸，用棉绳包扎后灭菌。

（6）吸头和Eppendorf管

吸头根据不同的规格戴手套加入不同的盒子；Ed管放入饭盒中，灭菌，50°烘干后备用。第11页，共40页，2023年，2月20日，星期四培养基的制备按物理状态分：液体培养基

固体培养基

1.5%—2%凝固剂

半固体培养基

少量凝固剂（0.2%—0.7%）

第12页，共40页，2023年，2月20日，星期四常用培养基成分一般细菌

牛肉膏蛋白胨培养基：

第13页，共40页，2023年，2月20日，星期四真菌

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：第14页，共40页，2023年，2月20日，星期四放线菌

高氏1号培养基：第15页，共40页，2023年，2月20日，星期四霉菌查氏培养基：第16页，共40页，2023年，2月20日，星期四酵母菌

（1）PDA

（2）麦芽汁培养基

（3）豆汁葡萄糖培养基

（4）YPD培养基

1%YeastExtract（酵母膏）2%Peptone（蛋白胨）2%Dextrose(glucose)（葡萄糖）若制固体培养基，加入2%琼脂粉第17页，共40页，2023年，2月20日，星期四（一）液体培养基的配制1、称量2、溶解加水至总容积的4/5左右，慢慢搅拌使其溶解。

如有需要，可加热。3、调PH培养基溶解均匀并冷却至室温用PH试纸测PH，

用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液调节PH。（缓

慢少量多加搅拌）再加水到所需的量。4、分装分装于三角瓶时，分装量不得超过容积的1/2。5、封口瓶口处盖上6~8层纱布，瓶口布外包一层牛皮

纸或两层报纸，用棉绳捆绑。6、灭菌做好标记，放入高压灭菌锅中120℃，20min7、冷却后接种第18页，共40页，2023年，2月20日，星期四（二）平板培养基的配制1、称量按比例称取一定量的琼脂粉（1.5%—2%），

放入三角瓶中。2、按液体培养基的配制1~3步操作，调好PH，定容3、分装分装量不得超过三角瓶的1/24、封口6~8层纱布，再外包一层牛皮纸或两层报纸5、灭菌做好标记，高压灭菌锅中120℃，20min6、冷却放入55℃烘箱或水浴中，温度降至55℃，进

入无菌室倒平板。第19页，共40页，2023年，2月20日，星期四7、倒平板在超净台的酒精灯火焰旁的无菌区内进行操作，右手那装有培养基的三角瓶，拔出试管塞；左手将培养皿的盖在酒精灯火焰旁打开一条缝，让三角瓶口深入；倒入培养基，盖好后顺着超净台边缘将平板推入，平放在超净台上。8、倒置

冷却至培养基凝固后，倒置平板，装入保鲜袋中扎好，放入4℃冰箱中保存备用。第20页，共40页，2023年，2月20日，星期四（三）斜面培养基的配制1、按液体培养基配制1~3步操作，调好PH，定容2、称量

称取1.5%~2%的琼脂粉，加入已溶解的药品中，再熔

化

琼脂（控制火力，防止培养基溢出，不断搅拌），

最后补足所失的水分。3、分装

趁热分装于试管内，分装量不超过高度的1/5~1/4，不

要污染试管塞。4、灭菌

加试管塞，7支成一捆，试管塞外包一层牛皮纸，或两

层报纸，贴上标签。高压蒸汽锅中121℃，20min。第21页，共40页，2023年，2月20日，星期四5、摆斜面

温度降至55℃左右，将灭菌后的斜面培养基，趁热放于玻璃棒或移液管上，调整斜度，培养基的斜面不超过试管长度的1/2。6、保存

冷却后，装入保鲜袋中扎好，置于4℃冰箱中。第22页，共40页，2023年，2月20日，星期四（四）半固体培养基的配制1、称量

称取0.7%左右的琼脂粉2、同固体培养基相同第23页，共40页，2023年，2月20日，星期四（五）无菌水的准备1、100ml三角瓶（装有玻璃珠），装双蒸水45ml2、试管装4.5ml双蒸水3、塞上管塞或盖上塑料盖子4、包扎、灭菌5、备用第24页，共40页，2023年，2月20日，星期四注意事项1、药匙不要混用2、PH：(1)调PH要逐步滴加，勿使过酸过碱，破坏培养

基中的某些成分，防止回调或反复调整PH。

（2）灭菌后PH会发生改变，要注意检测灭菌后的PH状况。（较特殊的用于确定最适PH，最值PH）3、琼脂：待液体培养基煮沸后，再加入琼脂。4、分装：避免培养基粘到管口或瓶口，如不小心粘上，

应立即擦干净。5、制斜面和平板的培养基：温度不宜太高，一般60℃左右。第25页，共40页，2023年，2月20日，星期四6、试管塞：1/2~2/3进入试管内。7、液体培养：三角瓶内的培养基量一般为1/5~1/3,不应

超过容积的1/2。8、斜面培养：培养基装量为试管高度的1/5~1/4，灭菌

后制成的斜面长度不超过1/2。9、半固体培养：培养基为试管高度的1/3,灭菌后垂直

待凝。10、平板：100ml5~6个平板

一个平板大约15~20ml培养基，铺满皿底高

1.5~2mm第26页，共40页，2023年，2月20日，星期四灭菌与消毒灭菌

采用强烈的理化因素，使微生物永远失去其生长繁殖的能力，如121℃高压灭菌20min。消毒

采用一种较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。如用70%酒精进行皮肤表面的消毒。防腐

利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品发生霉腐。第27页，共40页，2023年，2月20日，星期四物理消毒灭菌1、干热灭菌法

原理：细胞内蛋白质凝固变性

方法：火焰灼烧灭菌&热空气灭菌

特点：温度高160℃~180℃，2h2、湿热灭菌法

原理:高温使原生质中的蛋白质凝固变性，破坏酶

的活性。

方法：高压蒸汽灭菌法第28页，共40页，2023年，2月20日，星期四3、紫外线灭菌法

原理：（1）诱导胸腺嘧啶二聚体形成，抑制DNA

复制；

（2）辐射使O2电离为[O]，然后形成O3，

或是水形成H2O2；

缺点：杀菌能力较强，但穿透力弱，一张薄纸，

玻璃或水层就可滤过大部分的紫外线。对象：空气和表面杀菌第29页，共40页，2023年，2月20日，星期四4、过滤除菌

原理：通过机械作用滤去液体或其气体中的细菌。

对象：不能采用加热灭菌的物质，如维生素、血

清、抗生素、酶液等

缺点：滤量有限，只适用于实验室小量溶液

（20ml以下）的过滤除菌。5、化学药剂消毒灭菌第30页，共40页，2023年，2月20日，星期四高压蒸汽灭菌法1、在高压锅内加入一定量的水，将包扎好的物品放入物品框中。2、接通电源，进行加热。3、将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压强升到0.5kg/cm2时，再打开排气阀，待压强回到0时关闭排气阀。4、压强达到1kg/cm2时，灭菌锅内的温度为121℃，维持20~30min。5、灭菌时间一到，切断电源，待压强降至0打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。第31页，共40页，2023年，2月20日，星期四注意事项1、加上锅底水，防止干烧；2、锅内物品之间留有缝隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。4、三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。5、尽可能排出锅内冷空气；6、灭菌结束后，要缓慢放气降压（尤其是液体培养基灭菌），切勿突然打开排气阀降压，会引起瓶子爆破或培养基沸腾冲出容器，污染试管塞，瓶口布。第32页，共40页，2023年，2月20日，星期四微生物的无菌操作实验前无菌室的紫外线杀菌

第33页，共40页，2023年，2月20日，星期四注意事项1、操作区消毒：无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。2、消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。3、实验用品，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台，同时紫外线消毒。第34页，共40页，2023年，2月20日，星期四4、操作：开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作，动作要准确敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空气流动，增加污染机会。5、必要物品，如试管架，移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。6、实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。第35页，共40页，2023年，2月20日，星期四7、为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。8、工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。9、实验结束后，将实验物品带出工作台，如需要继续进