平面色谱法级药学

平面色谱法级药学第1页，共54页，2023年，2月20日，星期四第一节平面色谱法的分类和原理第二节薄层色谱法第三节纸色谱法本章内容第2页，共54页，2023年，2月20日，星期四第一节平面色谱法的分类和原理一、平面色谱法的分类组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。

按操作方式1薄层色谱法（thinlayerchromatography）2纸色谱法(paperchromatography)3薄层电泳法(thinlayerelectrophoresis)吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻薄层色谱法等等按分离机制第3页，共54页，2023年，2月20日，星期四二平面色谱法参数定性参数：反映组分的保留行为相平衡参数：描述分离过程面效参数：衡量分离效能分离参数：衡量分离条件的优劣第4页，共54页，2023年，2月20日，星期四（一）定性参数1比移值(Retardationfactor,Rf值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。

Rf=L/L0（适宜范围0.2~0.8，最佳0.3~0.5）

L——原点至斑点中心的距离

L0——原点至溶剂前沿的距离

展开溶剂原点L0L前沿第5页，共54页，2023年，2月20日，星期四1比移值(Retardationfactor,Rf值)①

Rf数值与组分及色谱条件（薄层板活性，展开剂等）和温度有关②实验中满足下列条件，可获得真实Rf值：

a展开槽密闭不泄露，薄层板周围空间被展开剂蒸汽所饱和，无边缘效应;b沿分离轨迹固定相与流动相无梯度变化;c展开剂的前沿位置能正确测定。第6页，共54页，2023年，2月20日，星期四2相对比移值(relativeRf；Rr)

Rr=Rf

(i)/Rf

(s)=L(i)/L(s)与组分、色谱条件、参考物质有关。Rr值可以大于1，也可以小于1。重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差（参考物质与组分在完全相同的条件下展开）

第7页，共54页，2023年，2月20日，星期四1

分配系数K=

2保留因子

k=

=3分配系数K、保留因子

k与Rf值的关系：

(二)相平衡参数组分在固定相中的量组分在流动相中的量CsVsCmVmCsCmCs、Cm分别表示在达到分配平衡后，某物质在固定相和流动相中的浓度。第8页，共54页，2023年，2月20日，星期四（三）面效参数1

理论塔板数（n）n=16(L/W)22塔板高度（H）H=L0/n（四）分离参数1分离度（R）R>12分离数（SN）R=1.177时，

SN=L0/(b0+b1)-1,dW1W2Rf=0Rf=1前沿原点SN:7~10（一般TLC板）

10~20（高效TLC板）第9页，共54页，2023年，2月20日，星期四第二节薄层色谱法

(thinlayerchromatography；TLC)一定义、特点、主要类型二吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂三薄层色谱操作方法四定性和定量分析五高效薄层色谱法六薄层扫描法简介七在药物研究中的应用第10页，共54页，2023年，2月20日，星期四薄层色谱法特点：1分析速度快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。2试样预处理简单，对试样限制少。3载样量比较大，适用于制备。4仪器简单，操作方便。5分离能力较强，分析结果直观。一薄层色谱法定义、特点及主要类型定义：将吸附剂或载体涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质比较）进行定性定量。

第11页，共54页，2023年，2月20日，星期四薄层色谱法的主要类型1吸附薄层色谱法原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。

吸附系数Ka

大小不同实现分离极性强的组分Ka

大，Rf值小；极性弱的组分Ka

小，Rf值大。

第12页，共54页，2023年，2月20日，星期四2分配薄层色谱法原理：多次分配的过程，分配系数（溶解度）大小不同实现分离分类：按流动相与固定相极性大小（1）正相色谱固定相：含水硅胶流动相：有机溶剂。 极性强的组分K大，Rf值小。（2）反相色谱：固定相：烷基化学键合相流动相：水－有机溶剂。 极性强的组分K小，Rf值大。第13页，共54页，2023年，2月20日，星期四3凝胶薄层色谱法：

用葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等铺成薄层板进行大分子化合物的分离。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，是利用其网孔大小把分子大小和形状不同的大分子化合物分开（一般是分开成组，而不能分开为单一化合物），又称为排阻或分子筛层析法。4胶束薄层色谱法(micellarTLC)：

用低浓度表面活性剂的水溶液为流动相，当所用的表面活性剂水溶液需超过某一浓度（临界胶束浓度CMC）时多余的表面活性剂不再溶解，而聚集成胶束（胶粒），因流动相为胶体分散体系，故称为胶束液相色谱。薄层色谱法的主要类型第14页，共54页，2023年，2月20日，星期四二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂（一）吸附剂

1硅胶：多孔性无定形粉末，表面带有硅醇基（≡Si-OH），呈弱酸性,表面pH≈5。

原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。

应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等。碱性物质与硅胶作用，展开时被吸附、拖尾、甚至展不开。第15页，共54页，2023年，2月20日，星期四硅胶活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活化：加热至100℃左右，除去吸附水提高度。（注意温度不可过高，硅醇基→硅氧基）分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。一般地(10-40μm)(100nm)(400-600m2/g)常用硅胶：①硅胶H——不含黏合剂②硅胶G(Gypsum,石膏)：含煅石膏（CaSO4·1/2H2O）③硅胶GF254：含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。第16页，共54页，2023年，2月20日，星期四2氧化铝（活度也与含水量有关）碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；

中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)——

酸性化合物的分离。第17页，共54页，2023年，2月20日，星期四3聚酰胺聚己内酰胺：白色多孔性非晶型粉末酰胺基与化合物质子给体形成氢键而对化合物产生吸附。应用：酚、酸、硝基、醌类等分离第18页，共54页，2023年，2月20日，星期四（二）展开剂(流动相)

选择原则：同吸附柱色谱，根据被分离物质的极性、吸附剂活度、展开剂极性Stahl简图：例：极性物质↓活度低（活性级大）的吸附剂↓极性展开剂

第19页，共54页，2023年，2月20日，星期四

常用溶剂的极性强弱顺序★

★水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>环己烷>石油醚极性强的溶剂，洗脱能力强第20页，共54页，2023年，2月20日，星期四单一溶剂展开→分离效果Rf

？→

Rf值太小：加极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等；→

Rf值太大，加极性弱的溶剂，如环己烷、石油醚等；→可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。展开剂混合溶剂第21页，共54页，2023年，2月20日，星期四三、薄层色谱操作方法1制板均匀2点样集中3展开(多种方式)预饱和4斑点定位

第22页，共54页，2023年，2月20日，星期四1薄层板的制备（1）薄层板的选择表面光滑、平整、洁净，厚度一致玻璃板、塑料板或铝箔大小按实验需要选规格：

10cm×10cm10cm×l5cm20cm×10cm20cm×20cm

第23页，共54页，2023年，2月20日，星期四（2）薄层板的涂布：将固定相、粘合剂和水，按比例混合均匀、无气泡的固定相匀浆均匀玻璃板(厚度为0.25～0.5mm)玻板置室温下水平台上晾干在反射光及透射光下检视薄层板表面应均匀，干整，无麻点、无气泡、无破损及污染。研磨涂布（使用涂布器、倾倒涂层、浸涂、喷涂）第24页，共54页，2023年，2月20日，星期四（3）薄层板的活化一般活化：硅胶110℃烘30分钟，氧化铝110℃烘45分钟强活化：硅胶150℃烘4h，氧化铝180℃烘4h冷却后立即使用或置干燥箱中备用，或用商品预制板。第25页，共54页，2023年，2月20日，星期四2点样样品溶液：浓度0.01％～0.1％,溶剂：有机溶剂，如乙醇或甲醇等，避免用水；点样工具：点样毛细管或微量注射器点样基线距底边1.0-1.5cm样点一般为圆点，直径一般2-4mm采用分量多次点，每次点样需自然干燥或电吹风吹干后，才能二次点样。点样量:几微升，薄层定量或薄层制备时，可几百微升点样时必须注意勿损伤薄层表面。

第26页，共54页，2023年，2月20日，星期四3展开将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至规定距离，除另有规定外，一般为8～15cm，取出薄层板，标记溶剂前沿，晾干，按具体试验的规定检测。展开缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，必要时并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，盖严，使展开缸平衡。避免边缘效应。第27页，共54页，2023年，2月20日，星期四边缘效应：同一组分在同一板上处于边缘斑点的Rf比处于中心的Rf值大的现象。产生原因：展开剂的蒸发速度从薄层中央到两边缘逐渐增加，即处于边缘的溶剂挥发速度较快。在相同条件下，致使同一组分在边缘的迁移距离大于中心的迁移距离。薄层色谱的边缘效应展开剂：氯仿-甲醇（95：5）展开距离10cm第28页，共54页，2023年，2月20日，星期四展开一个TLC板，一个紫色的斑点被分离为一个红色斑点与一个蓝色斑点第29页，共54页，2023年，2月20日，星期四样品的二次展开B一次展开C二次展开A点样溶剂展开方向第30页，共54页，2023年，2月20日，星期四4斑点的确定斑点位置的确定方法：（1）在日光灯下观察，画出有色物质的斑点位置；（2）在紫外灯下（254nm或365nm）观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱。（3）254nm紫外灯下，掺入了少量荧光物质的薄板呈黄绿色荧光，被测组分在荧光薄层板上猝灭而产生暗斑进行检出。(注意带防护眼镜)（4）利用显色剂显色斑点（适合无色无紫外吸收的物质）。

第31页，共54页，2023年，2月20日，星期四通用型显色剂：碘：生物碱、氨基酸类、肽类、脂类、皂苷类10％硫酸乙醇溶液：105℃加热10-15min，大多数有机物（红色、棕色、紫色或出现荧光）0.05％荧光黄甲醇溶液：芳香族与杂环专属型显色剂：如：0.3%茚三酮丁醇溶液（含3%醋酸）检测氨基酸及脂肪伯胺类化合物，显粉红色到紫色；等等第32页，共54页，2023年，2月20日，星期四10种精油通过薄层色谱展开后，再使用香草醛试剂显色后的效果。第33页，共54页，2023年，2月20日，星期四四、定性和定量分析1定性分析

a比较Rf值或Rr值、斑点颜色或荧光b常采用已知标准物质对照（同一板上展开）c多种展开系统的Rf值与对照品一致。2定量分析

a洗脱法b直接定量法

b1.目视比较法（如杂质检查方法）

b2.薄层扫描法第34页，共54页，2023年，2月20日，星期四

杂质检查方法1杂质对照品比较法：配制试样溶液（A）和规定限量浓度的杂质对照品溶液（B）斑点颜色：试样中杂质不得比杂质对照品深2主成分自身对照法供试品溶液（A1）,将其稀释一定倍数得到低浓度溶液（A2）作为对照溶液,将供试液和对照液一同展开，供试液中杂质斑点颜色不得比对照液主斑点深。AB杂质A1A2杂质主斑点第35页，共54页，2023年，2月20日，星期四五高效薄层色谱法1高效薄层板：商品预制板2点样：浓溶液一次点样点样器：铂-铱合金点样毛细管、微量注射器或专用点样仪器。3展开：与经典薄层色谱法相同的展开方式。或专用高效薄层色谱展开槽（重现性较好）。4定量分析：均采用薄层扫描仪定量分析。第36页，共54页，2023年，2月20日，星期四六薄层扫描法简介（一）薄层扫描法基本原理用一定波长和强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点扫描，用仪器测量透过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。

斑点扫描积分面积－物质含量第37页，共54页，2023年，2月20日，星期四（二）薄层扫描仪组成：主机：光源：可见光源钨灯400-800nm

紫外光源氘灯200-400nm

（光源选择杆变换）

分光器：光栅200-800nm

检测器：光电倍增管

数据处理及信号输出第38页，共54页，2023年，2月20日，星期四1薄层色谱扫描仪光束系统光波长1波长2检测器斩波器光波长1检测器光波长1检测器斩波器A单光束B双光束C双波长第39页，共54页，2023年，2月20日，星期四2.1透射法光源与检测器在薄层板上下两侧。光源发出的光经单色器成为一定波长的单色光，光束照到薄层斑点上，测量透射光强度。实际应用少光源单色器2薄层色谱扫描仪测定方法第40页，共54页，2023年，2月20日，星期四2.2反射法光源与检测器在薄层板同侧。光源发出的光经单色器成为一定波长的单色光，光束照到薄层斑点上，部分被薄层吸收，部分经过漫反射又折回表面成为反射光，测量反射光强度，得到反射光谱。反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定量。光源单色器第41页，共54页，2023年，2月20日，星期四3薄层色谱扫描仪扫描方式直线型扫描（linearscan）用一束比斑点宽度略宽的光作一个方向的等速扫描。锯齿型扫描(zigzagscan）或称飞点（flyingspot）扫描用微小的正方形光速在对斑点进行Y轴等速直线扫描的同时对斑点进行X轴等辐往复扫描，光束运动轨迹呈锯齿形。直线扫描锯齿扫描轮廓曲线积分曲线第42页，共54页，2023年，2月20日，星期四A

B

C斑点ABC对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。直线扫描锯齿扫描第43页，共54页，2023年，2月20日，星期四4散射参数的选择——非线性关系的校正曲线校正：实验前根据薄层板的类型，选择合适的散射参数（SX），由计算机根据适当的修正程序，自动进行校正。曲线较直后方可进行定量分析。岛津薄层扫描仪一般设有10个散射参数，硅胶薄层板，SX一般选用3，氧化铝板选7.样品量吸光度DCBAA未校正的标准曲线B校正不够C校正合适D校正过头第44页，共54页，2023年，2月20日，星期四5

定量分析法（１）外标法：分别配制对照品溶液和样品溶液，先做出标准曲线，然后在同一块薄层板上交叉点对照品溶液和样品溶液，根据标准曲线（对照品含量和峰面积值）和样品的面积值计算出样品的含量。（２）外标一点法（３）外标两点法A1aC10AxCx外标一点法A1aC10A2CxC2b外标两点法第45页，共54页，2023年，2月20日，星期四6分析误差薄层分析的误差包括三个方面：点样误差、展开误差、定位误差和检测误差。采用自动点样器，误差可控制在0.5%，熟练的分析人员用毛细管点样，误差小于1.0%，若用微量进样器，误差会大一些。展开误差来自铺板的均匀性和样品展开效果，若采用预制的高效薄层板，误差会明显降低，采用双波长锯齿扫描，也能有效降低展开误差。第46页，共54页，2023年，2月20日，星期四定位误差：斑点的位置和大小判定，扩散、脱尾等易产生定位误差。检测误差来自光源的稳定性、光检测器的稳定性以及样品对光吸收（或荧光产生）的线性度等方面。为减少这些误差，需要非常精密的机电系统，这也直接导致产品高昂的价格。通常情况下，薄层扫描分析的误差可控制在3%以下。第47页，共54页，2023年，2月20日，星期四七薄层色谱法在药物分析中的应用1药物与毒物的快速鉴定；2药物的鉴别和纯度检查；3混合物质的分离和微量提纯（包括异构体的分离）；4复方制剂的定性与定量分析；5药物及其制剂在制备和贮藏过程中的稳定性考察，及有关质量的研究；卤菜中色素的鉴别第48页，共54页，2023年，2月20日，星期四6体液中药物及其代谢物的分离分析；7中草药有效成分的分离、提纯与研究；8化学药物合成反