中药化学成分研究一般方法

中药化学成分研究概况及发展趋势历史中国：公元12世纪，使用大麦发芽制造饴糖；明代李时珍《本草纲目》中记述五倍子“看药上长起长霜，药则已成”，长霜即为没食子酸结晶，另外还记述了升华法制备纯化樟脑的过程。古代我国处于世界领先地位。近代至新中国成立之前，我国中医药发展几乎停滞，直到20世纪70年代以后才有较大发展。第一页，共59页。日本：近几十年发展迅速，对众多常用中药的化学成分进行了较深入的研究，取得了一大批领先成果。如人参、黄芪、葛根、芍药、柴胡等。中药化学研究概况：建国以来我国从中药或天然药物中研制开发的新药有40余种，例如青蒿素、川芎嗪、靛玉红等。我国作过比较深入的化学成分或药学研究的中药有200余种第二页，共59页。

有200余种有效成分被制成500余种制剂已用于临床。分离出的有效成分种类以生物碱、二萜、三萜、黄酮类居多。

20年代，我国开始研究麻黄碱（左旋麻黄碱），使麻黄碱成为世界性常用药物。麻黄碱具有兴奋中枢、收缩血管、增强汗腺、唾液腺分泌、缓解平滑肌痉挛等作用，是麻黄平喘的主要成分。

30年代发现了延胡索乙素（消旋四氢巴马丁）、汉防己甲素（粉防己碱）、汉防己乙素（防己诺林碱），均有镇痛作用。

40年代陆续生产了麻黄碱、芦丁、洋地黄毒苷、咖啡因、小檗碱、山道年、狄戈辛、西地兰、阿托品、长春新碱等。第三页，共59页。70年代以后羟基喜树碱—抗癌高三尖杉酯碱—抗白血病天花粉蛋白—引产青蒿素、蒿甲醚、双氢青蒿素—抗疟第四页，共59页。中药化学研究的发展趋势更注重以活性为指标追踪有效成分的分离，我国尤为重视建立符合中医药理论的活性指标，更能体现中医药特色。更注重多学科的密切配合（如药理学、药代动力学、分子生物学等），吸收新技术、新方法并结合中医药理论和传统经验。第五页，共59页。目前，对中药复方有效成分的研究方法有两种，一是将化学成分分离和药理活性测试分阶段交替进行。另一是以简单、灵敏、可靠的活性测试方法为向导，紧密结合已建立的能够确切反映复方疗效的动物模型，对分离的每一个部位进行活性定量评估，追踪活性部位，从而分离鉴定出活性成分。第六页，共59页。中药化学成分的研究方法中药化学成分的主要类型：（一）从物质基本类型分：有机物、无机物。（二）按元素组成、结构母核分：生物碱、黄酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等。（三）按酸碱性分：酸性、碱性、中性。（四）按溶解性分：非极性（亲脂性）、中极性、极性（亲水性）第七页，共59页。（五）按活性分：有效成分、无效成分有效成分：具有生物活性，能用分子式和结构式表示，并具有一定的物理常数的单体化合物。无效成分：与有效成分共存的无生物活性的成分称为无效成分。（六）按生合成途径分：一级代谢产物（如糖、蛋白质，脂肪）、二级代谢产物（如生物碱、黄酮、皂苷）。第八页，共59页。中药化学成分提取分离方法的基本

原理及应用一、基本概念1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。第九页，共59页。二、提取方法

水溶剂提取法：溶剂亲水性有机溶亲脂性有机溶水蒸气蒸馏法超临界流体萃取法（SFE）升华法压榨法第十页，共59页。（一）溶剂提取法1、原理根据中药中各种成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从药材组织中溶解出来的一种提取方法。选择溶剂依据相似相溶原理。第十一页，共59页。2、选择溶剂的要点

对所要成分溶解度大沸点适中容易回收低毒安全中药化学成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同（有点相似相容的感觉）。最常用的溶剂为乙醇。第十二页，共59页。3、溶剂的分类

强极性溶剂：水亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）亲脂性有机溶剂：不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）常用溶剂的极性大小顺序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水第十三页，共59页。

4、化合物的结构与亲水性、亲脂性的关系

（1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强，反之则亲脂性越强。（2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。（3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强，亲脂性越弱。看对称性来判断极性第十四页，共59页。5、溶剂的选择

(1)水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。清水的

(2)亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。(3)亲脂性有机溶剂：具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。第十五页，共59页。（二）水蒸气蒸馏法适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分的提取。挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。（三）超临界流体萃取法最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。（四）升华法（五）压榨法第十六页，共59页。三、分离精制方法（一）溶剂法（二）沉淀法（三）分馏法（四）膜分离法（五）结晶法（六）色谱分离法第十七页，共59页。（一）溶剂法

1、酸碱溶剂法（1）酸溶：有机碱性成分可与无机酸成盐而溶于水。（2）碱溶：具有羧基，用碳酸氢钠；具有酚羟基，用氢氧化钠；具有内酯或内酰胺结构的成分可被皂化而溶于水。

酸沉碱提法碱沉酸分法第十八页，共59页。2、溶剂分配法原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。一般采用全量多次分配提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。溶剂的选择：对于分离极性较大的成分，用正丁醇-水；分离中等极性成分，用乙酸乙酯-水；分离低极性成分，用氯仿（或乙醚、石油醚等）-水。所用装置：分液漏斗、连续液-液萃取装置、液滴逆流层析装置。第十九页，共59页。（1）系统溶剂萃取法：常用来粗分，是将总提物分散于水中，依次用石油醚（或环己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂得到相应极性的成分。第二十页，共59页。第二十一页，共59页。（2）逆流连续萃取法

利用两相溶剂比重不同可自然分层和分散液滴穿过连续相溶剂时发生传质的原理，用一根或数根萃取管制成逆流连续萃取装置。管内的瓷环，增加液滴上升的路程和在连续相中停留的时间，更重要的是上升的液滴因撞击填充物而被分散，扩大了两相溶剂萃取的接触面积，使更萃取完全。优点：克服了分液漏斗多次萃取和易乳化的麻烦。第二十二页，共59页。（3）逆流分布法（CCD）对性质相似的异构体或同系物分离效果好。基本原理仍是利用混合物中成分在两种不相混溶的溶剂中分配系数的不同，经过在两相溶剂中多次转移，而使它们达到分离的目的。（4）液滴逆流层析法（DCCC）是在逆流分布法基础上发展的高分离效能的逆流分布法，分离管有100~1000根，互相串联，上行法时，分离管内充满重相作为固定液相，利用泵将轻相（移动相）带着样品液进入分离管，形成液滴通过分离管，流出的移动相通过检测，分部收集。第二十三页，共59页。溶剂分配法中溶剂系统的选择：两相溶剂不相混溶，混合物中各单一成分在溶剂系统中的分配系数差别越大越好。分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好的溶剂。操作注意：（1）先将两相溶剂相互充分饱和。（2）采用等体积两相溶剂的方式。（3）欲分离混合物的浓度不宜过高。第二十四页，共59页。（二）沉淀法

1、酸碱沉淀法：例如：生物碱、黄酮、蒽醌

2、专属试剂沉淀法：例如：雷氏铵盐沉淀季铵碱、胆甾醇沉淀甾体皂苷；明胶沉淀鞣质。3、分级沉淀法：改变加入溶剂的极性或数量使沉淀逐步析出的方法。例如：多糖、蛋白质的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，则可得到分子量由大到小的多糖、蛋白质；皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按极性从小到大逐步沉淀。第二十五页，共59页。4、铅盐沉淀法中性醋酸铅：与酸性或酚性物质沉淀碱性醋酸铅：除以上物质外，还可沉淀具有醇羟基、酮基、醛基结构的物质。脱铅：通入硫化氢法；中性硫酸盐法；阳离子交换法。5、盐析法在混合物的水溶液中，加入无机盐（常用的是NaCL，其它还有Na2S、MgSO4、NH4SO4）至一定浓度或达到饱和，使某些成分沉淀析出或用有机溶剂萃取出而达到分离的目的。第二十六页，共59页。（三）分馏法利用混合组分中各成分的沸点不同而分离的一种方法。用于液体混合物的分离。（四）膜分离法利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜分离技术。原理是大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到分离。关键是选择适宜的膜。第二十七页，共59页。（五）结晶法

1、结晶的条件（1）溶剂：选择合适的溶剂对结晶的形成是关键。合适的溶剂应对欲分离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热溶解度一致；沸点要适中；不与被分离成分产生化学反应。选择溶剂依据“相似相溶”原理。第二十八页，共59页。（2）温度通常在加温的情况下，溶解过滤，除杂，浓缩，放冷。最合适的结晶温度5~10度。（3）时间一般3~5天或更长时间。（4）浓度一般是多一些溶剂，放置使其慢慢挥发到合适的浓度。（5）杂质（6）有效成分的含量越高，越易结晶。第二十九页，共59页。2、结晶溶剂的选择对所需成分的溶解度随温度不同而有显著差别，同时不发生化学反应；查阅相关文件，参考“相似相溶”规律；选择混合溶剂，低沸点溶剂对物质溶解度大，高沸点溶剂对物质的溶解度小；常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等。第三十页，共59页。（六）色谱分离法1、吸附色谱利用同一吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离目的的色谱方法。吸附能力的强弱是由吸附剂和被吸附物质的性质决定的。吸附色谱法的分离效果，完全由吸附剂，溶剂和被分离物质的性质决定。第三十一页，共59页。（1）常用吸附剂：硅胶：多孔，微酸性，其吸附能力稍弱于氧化铝。吸附作用是由于颗粒表面有很多硅醇基，它可以和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，所以硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。硅醇基还易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱。吸水量超过12%就不能做为吸附剂了。第三十二页，共59页。当加热到了100-110℃时即可除去绝大多数硅醇基吸附的水分，恢复吸附活力，这一过程称为活化。当温度上升到500℃时，硅胶表面的硅醇基则脱水缩合转变为硅氧环结构，从而丧失吸附活性。硅胶适于分离的化合物范围很广泛，但不宜分离碱性化合物。第三十三页，共59页。*氧化铝由氢氧化铝直接在高温下脱水制得，带微碱性，适于分离碱性成分。聚酰胺适于分离黄酮、酚、醌类、有机酸及鞣质，可使性质极相近的化合物得到分离。原理：聚酰胺中的酰胺基可与酚羟基、羧基、羰基、硝基等形成氢键吸附。聚酰胺的吸附容量大。第三十四页，共59页。被分离成分的结构与吸附力的关系：1）可形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强，越难被洗脱。2）形成分子内氢键的吸附能力会减弱。3）分子中芳香化程度越高，吸附能力越强。4）对聚酰胺柱的洗脱能力，与溶剂的种类有关：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次减弱。第三十五页，共59页。（2）溶剂对于极性吸附剂，溶剂极性越大，洗脱能力越强。对于非极性吸附剂，则相反。（3）被分离物质对于极性吸附剂，被分离物质的极性越强，吸附力越大，越难洗脱。第三十六页，共59页。（4）操作方式（1）薄层色谱：制板点样展开显色（2）柱色谱：装柱上样洗脱收集浓缩检识合并结晶第三十七页，共59页。（二）分配色谱1、基本原理利用物质在固定相和流动相之间分配系数不同而达到分离。2、分类正相色谱：固定相极性>流动相极性，用于分离极性和中等极性的成分。反相色谱：固定相极性<流动相极性，用于分离非极性和中等极性的成分第三十八页，共59页。3、洗脱规律：正相色谱中，极性小的化合物先被洗脱，极性大的化合物后被洗脱；反相色谱正好相反。4、常用的固定相和流动相固定相：正相色谱中常用氰基或氨基键合相；反相色谱中常用C18或C8键合相。流动相：正相色谱中主要用有机溶剂；反相色谱中常用甲醇-水或乙腈-水系统。第三十九页，共59页。（三）离子交换色谱法1、基本原理基于各成分解离度的不同而分离。

2、离子交换剂的种类离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶。3、应用主要用于生物碱、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等水溶性成分的分离纯化。4、操作要点装柱前要用水充分溶胀，并用酸、碱预处理。第四十页，共59页。（四）大孔吸附树脂法1、性能及分离原理（1）性能：大孔树脂是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。一般为白色颗粒，20~60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。水溶液中吸附力较强，且有很好的选择性。（2）原理既有吸附性，又有分子筛的筛选性。吸附性是范德华引力或氢键吸附的结果；筛选性则由其多孔性网状结构引起的。第四十一页，共59页。2、影响分离的因素（1）分子极性的大小极性较大的化合物适宜于在中极性的树脂上分离，而极性较小的化合物则适于在非极性树脂上分离。对于中极性树脂来说，被分离化合物分子上能形成氢键的基团越多，吸附力越强。（2）分子体积的影响对于非极性大孔吸附树脂而言，化合物体积越大，吸附力越强，这与大体积分子疏水性强有关。第四十二页，共59页。（3）PH一般酸性化合物在适当酸性溶液中可被充分吸附，碱性化合物则在碱性条件下易被吸附，中性化合物在中性情况下吸附较好。3、树脂柱的清冼和再生用乙醇、丙酮、异丙醇、2~5%盐酸、2~5%氢氧化钠渗漉法洗脱或回流。4、洗脱顺序一般被分离物质极性越小，越先被洗脱下来，极性越大，越后洗脱下来。第四十三页，共59页。5、应用（1）成分的类型与树脂的选择：（2）优点：吸附容量大，选择性好，成本低，收率较高，再生容易等优点。第四十四页，共59页。（五）凝胶色谱法1、性能及分类葡聚糖凝胶是葡聚糖和甘油，通过醚桥键相交而成的多孔网状结构物质。交链度越大，网状结构越紧密，网孔越小，吸水膨胀就越大，可用于小分子量物质的分离。反之，则用于大分子量物质的分离。常用的有葡聚糖凝胶（SephadexG）、羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）、聚丙烯酰胺凝胶（Sephacrylose,商品名Bio-gelP）及琼脂糖凝胶（Sepharose,商品名Bio-GelA）等。第四十五页，共59页。2、分离原理葡聚糖凝胶吸水后，形成凝胶粒子，在交链键的骨架中存在着许多网眼，只能使小分子量的化合物进入，大分子量的化合物被排阻在凝胶颗粒的外部难以进入网眼内部，因此大分子物质首先被洗出。3、应用主要用于分离水溶性大分子化合物。（六）高效液相色谱（七）气相色谱第四十六页，共59页。中药化学成分结构测定的一般程序和方法（一）纯度测定外观颜色形态是否均一；测定物理常数如：熔点、沸点、比旋度、折光率等；用薄层色谱或高效液相色谱鉴别；如为已知物，可用对照品进行对照。（二）化学方法颜色反应；化学降解法；衍生物制备。第四十七页，共59页。（三）波谱在结构测定中的应用1、红外光谱（IR)化合物用量只需5~10微克，测定范围500~4000cm-1,有两个区，一个是指纹区在1000cm-1以下，每个化合物有自己的特征指纹图谱；另一个是特殊功能区，在1000~4000cm-1

，可以确定羰基、苯环、羟基等功能基。第四十八页，共59页。2、紫外光谱（UV）只有在分子结构中具有共轭体系，即在分子中具有产生π-π、n-π跃迁和某些n-σ跃迁的化合物才能在紫外光区产生紫外吸收光谱。可根据紫外吸收光谱的位置及吸收峰的数目，可初步推测化合物的不饱和部分结构。第四十九页，共59页。3、核磁共振(NMR)(1)1H-NMR:提供不同种类氢原子的情况。给出氢的数目、种类、相邻基团的结构。可提供的结构信息参数，主要为化学位移(δ),偶合常数(J)及质子数。化学位移(δ)：因氢核周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，则不同的氢出现在不同区域。第五十页，共59页。偶和常数(J)：磁不等同的两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合产生裂分，裂分峰间的距离为J。（2）13C-NMR:提供碳原子的情况。可提供的结构信息参数，主要为化学位移、异核偶合常数(JCH)及弛豫时间。测定技术也有各种去偶方法，最常用的是质子宽带去偶，13C信号在图谱上为单峰。第五十一页，共59页。4、质谱(MS)测定有机分子的分子量。正确判断离子峰，提供分子量。分析碎片离子，推断结构信息。常用的有：电子轰击质谱（提供分子离子峰和碎片离子峰）；场解析质谱（可得到明显的分子离子峰）等。第五十二页，共59页。糖类化合物一、概述糖（saccharides）是多羟基醛或酮及其衍生物、聚合物的总称。通式为Cx(H2O)y，所有生物均含糖及其衍生物。二、结构和分类按能否水解和分子量大小分为：单糖(monosaccharides)：不能再被水解，最小单位。低聚糖(oligosaccharides)：2~9个单糖聚合而成。多糖(polysaccharides)：10个以上单糖聚合而成。植物多糖、菌类多糖、动物多糖。第五十三页，共59页。1、植物多糖：（1）纤维素：直链葡聚糖。（2）淀粉：直链的糖淀粉：1α4连接的D-葡萄吡喃糖，聚合度300-350，可溶于热水成透明溶液。支链的胶淀粉：1α4连接的D-葡萄吡喃糖，但有1α6的分支链，平均支链长25个单位，不溶于冷水，溶于热水成粘胶状。糖淀粉遇碘显兰色，胶淀粉显紫色。淀粉在制剂中作赋形剂，工业上