基因工程技术研究进展

Chapter8Advancesintransgenictechnology

1.InducibleexpressionsystemsInmanygene-transferexperiments,theproductionofarecombinantproteinistheultimategoal,inwhichcaseitisgenerallyappropriatetomaximizetransgeneexpressionusingastrongconstitutivepromoter.However,therearealsosituationsinwhichconstitutivepromotersarenotappropriate.Forexample,arecombinantproteinistoxic;thetimingoftransgeneexpressioniscritical;thetissueororganspecificityofintransgeneexpressionisrequired.现在是1页\一共有57页\编辑于星期三原核生物基因的结构1）基因区原核生物的基因多数以操纵子形式存在，即完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动区的调控之下，下游同具一个终止子。但各基因分别具有起始密码子和终止密码子。基因之间一般都存在间隔序列。1.1genestructure1.1.1promoter1.1.2codingregion1.1.3terminator现在是2页\一共有57页\编辑于星期三2）启动子(是和RNA聚合酶识别、结合的一段DNA序列)启动子(promoter)是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并起始转录。（1）Pribnowbox（－10区）由六个核苷酸组成的保守序列TATAAT，是RNA聚合酶的结合位点，此区的中央大约位于转录起始位点上游10bp处。（2）－35区由六个核苷酸组成的保守序列TTGACA，是RNA聚合酶的识别位点，此区的中央大约位于转录起始位点上游35bp处。

现在是3页\一共有57页\编辑于星期三现在是4页\一共有57页\编辑于星期三现在是5页\一共有57页\编辑于星期三现在是6页\一共有57页\编辑于星期三3）SD区Shine-Dalgarno序列：位于起始密码子上游约10bp处，富含嘌呤的保守序列(转录mRNA序列为5’-AGGAGGU-3’)，该区转录的序列与30S亚基中16SrRNA富含嘧啶的序列(5’-GAUCACCUCCUUA-3’)互补。4）转录终止子在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端，提供转录停止信号的DNA序列称为终止子(terminator)。所有原核生物的终止子产生的RNA可形成由茎环构成的发夹结构。该结构可使聚合酶减慢移动或暂停RNA的合成。现在是7页\一共有57页\编辑于星期三终止位点上游一般存在一个富含GC碱基（7-20bp）的双重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发夹结构。AGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU发卡结构GCAUCGCGGCCGCGGC

CACAAUUUU

CUCUG现在是8页\一共有57页\编辑于星期三真核生物基因的结构1）基因区真核生物染色体基因组的基因一般单独存在。在基因内部有1至多个非编码间隔序列区，称为内含子（intron）。而编码序列区称为外显子(exon)。尽管某基因是由多个外显子和内含子组成的，但只有一个起始密码子和一个终止密码子。现在是9页\一共有57页\编辑于星期三2）转录启动区启动子的结构特点TATAbox：真核基因的启动子在－25～－35区含有TATA序列，确保转录精确地起始。CAATbox：在－70～－80区含有CCAAT序列，控制转录起始频率。GCbox：在－80～－110区含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制转录起始频率。现在是10页\一共有57页\编辑于星期三3）转录终止子一般情况下，RNA聚合酶启动基因转录后，它就会沿着模板不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA脱离并释放新生RNA链。现在是11页\一共有57页\编辑于星期三基因表达包括转录和翻译两个阶段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程，是基因表达的核心步骤；翻译是以转录生成的mRNA为模板合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。DNAReplicationTranscriptionTranslation1.2geneexpression（基因的表达）现在是12页\一共有57页\编辑于星期三1.2.1transcription（转录）现在是13页\一共有57页\编辑于星期三1）转录的基本过程（1）模板识别RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之结合的过程。（2）转录起始在启动子区，RNA聚合酶合成9个核苷酸短链。（3）转录延伸RNA聚合酶离开启动子区，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程。（4）转录终止RNA聚合酶识别特定的终止位点，核苷酸不再加到链上，转录复合物停止移动，酶和RNA从模板上释放。现在是14页\一共有57页\编辑于星期三核糖体的活性中心：mRNA结合部位接受AA-tRNA部位（A位）肽基转移部位（P位）1.2.2translation现在是15页\一共有57页\编辑于星期三a.30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1,IF-3结合。b.30S小亚基通过Shine-Dalgarno序列与mRNA模板结合，在IF2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA的反密码子与mRNA上的密码子配对。c.由tRNA,mRNA,3个翻译起始因子组成的的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。现在是16页\一共有57页\编辑于星期三Step1:新的aa-tRNA进入A位点反密码子与mRNA密码子配对不正确的tRNA结合较弱，在肽键形成之前发生解离。正确的tRNA解离较慢，可以形成肽键(需要EF-Tu、GTP及EF-Ts)。Step2:肽键形成P位新生肽链C端与tRNA分开，与A位aa-tRNA上的氨基酸形成肽键Step3:移位2个tRNA由各自的P、A位移动到E、P位（EF-G介导GTP水解提供能量）（2）肽链的延伸现在是17页\一共有57页\编辑于星期三现在是18页\一共有57页\编辑于星期三（3）肽链的终止

A位点的终止密码子不能为任何一种tRNA所识别释放因子RF可结合到A位点P位的肽酰基tRNA的脱酰化，释放新生肽链RF3参与的依赖GTP的反应导致RF1离开核糖体70S/mRNA/deacylatedtRNA复合物的解体现在是19页\一共有57页\编辑于星期三1.3controlofgeneexpression1.3.1controlofprokaryotictranscription乳糖操纵子的表达调控大肠杆菌乳糖操纵子（lactoseoperon）包括四个重要组分：调节基因、启动区（promoter）、操纵区（operator）、结构基因(LacZ编码β—半乳糖苷酶,功能是使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖;lacY编码β—半乳糖苷透过酶,功能是使乳糖进入细菌细胞内;lacA编码β—半乳糖苷乙酰基转移酶,功能是使β—半乳糖乙酰化)。现在是20页\一共有57页\编辑于星期三现在是21页\一共有57页\编辑于星期三4乳糖操纵子在基因工程中的应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside,IPTG）现在是22页\一共有57页\编辑于星期三1.3.2controlofeukaryotictranscription1真核基因表达调控的类型1）DNA水平上的基因表达调控2）转录水平上的基因表达调控3）转录后水平上的基因表达调控4）翻译水平上的基因表达调控5）蛋白质加工水平上的基因表达调控现在是23页\一共有57页\编辑于星期三2.转录水平上的基因表达调控（基因表达调控的重要方式）

真核基因表达调控主要也是在转录水平上进行的，通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的。

1）顺式作用元件真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的，由于它们常与靶基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。（1）启动子①启动子的特点启动子是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列。现在是24页\一共有57页\编辑于星期三①启动子的结构特点TATAbox：真核基因的启动子在－25～－35区含有TATA序列，确保转录精确地起始。CAATbox：在－70～－80区含有CCAAT序列，控制转录起始频率。GCbox：在－80～－110区含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制转录起始频率。现在是25页\一共有57页\编辑于星期三将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件（upstreampromoterelement,UPE）。现代分子生物学把能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件（responseelement）。现在是26页\一共有57页\编辑于星期三②启动子的类型Ⅰ）组成型启动子Ⅱ）组织或器官特异性启动子启动子具有控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目、及相对位置等共同决定。如根特异性启动子、茎特异性启动子、叶特异性启动子、花特异性启动子、果实或种子特异性启动子等。Ⅲ）诱导型启动子启动子具有应答元件，如热激应答元件。诱导型启动子包括光诱导型启动子、温度诱导型启动子、创伤诱导型启动子、激素应答启动子等。受热后，果蝇细胞内热激蛋白70mRNA水平提高1000倍，就是因为热激因子（蛋白）与热激蛋白70基因TATA区上游60bp处的热激应答元件结合，诱发转录起始。现在是27页\一共有57页\编辑于星期三2）反式作用因子起始转录所需的任何一种蛋白质（除去RNA聚合酶），就是转录因子（TF,transcriptionfactor）。转录因子是一种重要的反式作用因子,是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的蛋白,通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用,激活或抑制转录。反式作用因子的四种作用方式：（1）通过与DNA结合发挥作用（2）一个转录因子可以识别另一个转录因子（3）可识别RNA聚合酶（4）当有其它几种蛋白质存在时可以掺入转录起始复合物现在是28页\一共有57页\编辑于星期三(1)转录因子的种类基础转录因子(basalfactor)：是RNA聚合酶II在所有启动子上形成转录起始复合物时所需的转录因子。活化因子(activator)：是通过作用于启动子以刺激RNA聚合酶的结合，从而刺激基因表达。真核生物中，活化因子结合的启动子中的序列，称为应答元件。协同活化因子(coactivator)：不结合DNA，是活化因子和基础转录因子相互作用时所需要的转录因子。现在是29页\一共有57页\编辑于星期三螺旋转角螺旋锌指结构亮氨基拉链螺旋环螺旋同源异形结构域现在是30页\一共有57页\编辑于星期三最初是在爪蟾(Xenopuslaevis)的RNA聚合酶III转录因子(TFIIIA)中发现的。9个串联重复的锌指区组成，每个单位大约由30个氨基酸残基组成。基序因在锌结合位点上突出的氨基酸环的形状如同手指，所以称为“指状”结构。这种蛋白质结构域是同DNA或RNA结合的部位。单个的锌指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His

这里x2、x5代表2个和5个任何一种氨基酸残基。现在是31页\一共有57页\编辑于星期三亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在双螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。由于这类蛋白质都以二聚体形式与DNA结合，两个蛋白质α螺旋上的亮氨酸一侧是形成拉链型二聚体的基础。然而，亮氨酸拉链区并不能直接结合DNA，只有肽链氨基端20～30个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。现在是32页\一共有57页\编辑于星期三（2）转录因子的作用作用于启动子之应答元件以刺激RNA聚合酶的结合，从而刺激基因表达.现在是33页\一共有57页\编辑于星期三能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件（responseelement），如热激应答元件（HSE,heatshockresponseelement），糖皮质应答元件（glucocorticoidresponseelement,GRE），金属应答元件（metalresponseelement,MRE）。它们与细胞内高度专一的转录因子(活化因子)相互作用，协调相关基因的转录。现在是34页\一共有57页\编辑于星期三现在是35页\一共有57页\编辑于星期三举例1：类固醇激素（性激素、糖皮质激素等）诱导的基因表达靶细胞内具有专一的细胞质受体（活化因子），可与激素形成复合物，导致三维结构甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内，并与染色质特定区域（应答元件）结合，导致基因转录的起始。现在是36页\一共有57页\编辑于星期三许多生物受热诱导时能合成一系列热激蛋白（heatshockprotein）。例如，受热后果蝇细胞内热激蛋白mRNA水平提高1000倍。此现象是由热激因子（heatshockfactor,HSF）与热激蛋白基因TATA区上游60bp处的热激应答元件（heatshockresponseelement,HSE）结合，诱发转录形成的。举例2：热激蛋白的诱导表达

现在是37页\一共有57页\编辑于星期三Heatstresseffectsonproteinsynthesisinsoybeanseedlings(J.Key).现在是38页\一共有57页\编辑于星期三Heat-shocktranscriptionfactor(HSF)BindstoHSEsContainsleucinezippermotifsActivityisinducedbyheat,andphosphorylationActivityRepressedbyHSP70现在是39页\一共有57页\编辑于星期三在没有受热或其它环境胁迫时，HSF主要以单体的形式存在于细胞质和核内。单体HSF没有DNA结合能力，Hsp70可能参与了维持HSF的单体形式。受到热激时，细胞内变性蛋白增多，它们与HSF竞争结合Hsp70，从而释放HSF，使之形成三体并输入核内。HSF一旦形成三体，便具有与HSE特异结合、促进基因转录的功能。现在是40页\一共有57页\编辑于星期三现在是41页\一共有57页\编辑于星期三举例3:cAMP信号系统调节基因转录CRE(cAMPresponseelement)

CREB(cAMPresponseelementbindingprotein)现在是42页\一共有57页\编辑于星期三诱导表达克隆载体诱导表达克隆载体中的启动子在特殊的诱导条件下才具有转录活性。例如热诱导表达克隆载体，糖皮质激素诱导表达克隆载体现在是43页\一共有57页\编辑于星期三基因在染色体定位整合的原理：同源重组2.Applicationofsite-specifichomologousrecombination(基因定位整合)现在是44页\一共有57页\编辑于星期三染色体定位整合克隆载体1基因整合平台系统1）整合平台指受体细胞染色体DNA上的一个特定区域，是外源DNA的定位整合位点。2）定位整合载体定位整合载体除了一般质粒克隆载体必须具备的元件外，还必须含有一个或两个与整合平台DNA序列同源的DNA片段（大于1kb）。现在是45页\一共有57页\编辑于星期三3.Furthertransgenicstrategiesforgeneinhibition3.1antisenseRNA

AntisenseRNAhastheoppositesensetomRNA.ThepresenceofcomplementarysenseandantisenseRNAmoleculesinthesamecellcanleadtotheformationofastableduplex,whichmayinterferewithgeneexpressionattheleveloftranscription,RNAprocessingorpossiblytranslation.现在是46页\一共有57页\编辑于星期三5´

CAUG

3´

mRNA

3´

GUAC

5´

AntisenseRNA反义RNA作用原理现在是47页\一共有57页\编辑于星期三In1988,Smithetal.generatedtransgenictomatoplantscarryinganantisenseconstructtargetingtheendogenouspolygalacturonase(PG)gene.Theproductofthisgeneisanenzymethatcausessofteningandleadstooverripening.ThelevelsofpgmRNAintransgenicplantswerereducedto6%ofthenormallevelsandthefruithadalongershelf-lifeandshowedresistancetobruising.现在是48页\一共有57页\编辑于星期三3.2RNAinterference(RNAi)

RNAiisanovelphenomenonthathasthepotentialtobecomeanextremelypowerfultoolforgenesilencinginanyorganism.OnlyafewmoleculesofdsRNAwerenecessaryforRNAi.InterferencecouldbeachievedonlyifthedsRNAwashomologoustotheexonsofatargetgene.DsRNAcreatssmallRNAmolecules,calledguideRNAs.GuideRNAsmayassemblewithcertainproteinstogenerateacatalyticendonucleasecomplexthatcleavestargetmRNAmoleculesefficientlyandinahomology-dependentfashion.现在是49页\一共有57页\编辑于星期三