2023年双特异性抗体回想

本文格式为Word版，下载可任意编辑——2023年双特异性抗体回想现代药物摸索杂志，2023年3月，00卷00号刊

导语：双特异性抗体将两种抗体的功能结合在一个分子中。目前市场上有两个双特异性抗体（一个近期被批准），还有更多正处于临床研发中。在大型制药企业的推动下，双特异性抗体正成为新一代的生物制品。

双特异性抗体

：RolandE.Kontermann和UlrichBrinkmann免疫和细胞生物学学院，斯图加特大学，德国

罗氏制药早期研发，大分子研究，罗氏创新中心，罗氏制药的研究和早期发展（PRED），大分子研究，罗氏彭茨贝格创新中心，彭茨贝格，德国

双特异性抗体（bsAbs）结合了两种抗体的特异性，可同时定位不同的抗原或表位。具有双目标靶向功能性的BsAbs可与多个表面受体或相关配体发生相互作用，例如与癌症、增殖或炎症进程。BsAbs还可以拉近多个目标，在一个细胞中支持蛋白复合物的形成，或使多个细胞发生接触。“强制连接〞功能的例子有在凝血级联反应或靶向免疫细胞招募剂和/或激活剂中，bsAbs支持蛋白质络合。经过多年的研究和研发（R＆D），2023年第一个bsAb被批准。其次个bsAb上市是在2023年12月，还有几个处在临床试验阶段。在这里，我们描述bsAbs成为下一波抗体为基础的治疗方法的潜力，侧重于临床开发中的分子。

重组双特异性抗体

重组类IgG双特异性抗体的概念原型二十多年前就被设计出来了。Morrison和他的同事们利用灵活的连接肽段将具有不同结合特异性的单链可变区融合到IgG重链的C末端。这种分子由于具有双重功能而与正常抗体区分开来。最初技术的瓶颈阻碍了其进一步发展，使双功能抗体始终主要是学术和生物技术领域研发的一个话题。然而，技术的快速发展使重组蛋白衍生物工程设计、生产和发展成为可能，加上来自制药工业的新的兴趣，双特异性抗体研究领域正式启动。现在，已经可以获得大量适合作为治疗用蛋白的不同的bsAb形式。初始阶段在学术领域中时常发生，多种蛋白构型都被证明足够有力支撑其临床应用。这也随后引发了制药企业的浓重兴趣，包括罗氏公司、辉瑞、基因泰克、赛诺菲安万特，艾伯维，中外制药，安进和其他公司，现在都在研发双特异性抗体药物。

起初，bsAb是将两个不同的、纯化的单克隆抗体（mAbs）通过化学交联生成，或者是将2株表达不同单克隆抗体的杂交瘤融合，构建4倍体杂交瘤。但是，两株异源抗体的轻重链随机装配，理论上体系中会有10多种不同组合的抗体存在，为抗体纯化和质控带来了巨大的挑战。在过去的二十多年里，基因工程技术导致了一系列双特异性重组抗体形式的产生，现在已经有50多种不同的形式。这使得治疗和诊断用的bsAb的发展发生了革命性变化，使研究人员可以根据目标产物特性要求来调整bsAbs的大小、化合价、灵活性、半衰期和体内分布。

一般来说，bsAb可以分成两大类，一类是含有Fc区，另一类是缺乏Fc区的，后者寻常小于免疫球蛋白和含有Fc区的类IgG双特异性分子（图1）。Fc区有利于采用已建立的针对IgG分子的流程来对bsAb进行纯化，并且能改善其溶解性和稳定性。此外，Fc区还对Fc-介导的效应功能有影响，可能是一些治疗应用所需的附加效应，例如抗体依靠的细胞毒性（ADCC）、补体结合（CDC）和由于其具有更大的分子量和Fc新生儿受体（FcRn）介导的循

环过程而导致的长半衰期。这些功能可以通过基因工程的手段进一步利用，例如，通过消除ADCC和/或CDC同时保存长半衰期。相比之下，缺乏Fc区的bsAb完全依靠其抗原结合能力来发挥治疗效力。

图1由两个不同抗原结合位点的抗体形成双特异性抗体的不同机制图解。

双特异性IgG分子可以由同一个细胞株表达的两条不同的轻链和重链组装而成。然而，由于不同肽链之间的随机组合会产生大量的相对双特异性抗体来说非功能性的分子。一个简单的解决方法是融合其次个结合部分，例如单链的Fv片段、单独的重链或轻链的N端或C端结构域、整个抗体的N端或C端结构域，这样产生一个对每个抗原有两个结合位点的四价分子（如图1）。含双可变区的免疫球蛋白(DVD-Ig)也属于对称的双特异性IgG和类IgG分子，其次个重链可变区与一个重链的可变区融合在一起，其次个轻链可变区与轻链融合（如图2）。通过选择VH和VL结构域结合两种不同抗原的能力可以实现双重识别（图2）。这种二合一抗体是二价的，有别于正常的IgG分子。

二价双特异性抗体分子的产生的一个突破是knobs-into-holes技术的发展。

（knobs-into-holes杂二聚技术，原理很简单，利用基因工程技术，在其中一条重链上做一个钮（knob），在另一条重链上做一个扣（hole），然后两个咬合在一起形成双抗。）通过在两个CH3结构域引入不同的突变来促使重链发生异源二聚化，由此产生不对称抗体。近年来在一般方法的基础上建立了好多新方法，例如利用选择性突变、静电转向效应、或IgG和IgA来源的混合CH3结构域。然而这些方法都有一个称为light-chainproblem

（轻链问题）的麻烦，就是不同的轻链与重链异源二聚体会发生随机配对。这可以通过采用一个能够同时结合两个抗原的共同的轻链来解决。然而，不是所有的抗体都适用。在这种状况下，可以采用细菌表达和组装分别含有匹配的轻-重链、含有凸起或凹洞的半抗体。CrossMab技术提供了一个完美的解决方案。正确配对的轻链是通过交换一条重链的CH1结构域和对应轻链的CL（轻链恒定区）结构域来获得的（图2）。最近，突变也被引入到Fab片段的表面的CH1-CL以及VH-VL区，由此产生轻重链的正确配对。值得注意的是，通过进一步融合一个抗原结合部分，非对称的重链同样可以作为产生二价双特异性，甚至三特异性抗体的基石。

图2临床研究阶段的不同形式的双特异性抗体

缺乏Fc区的小分子bsAb要么由两个抗体的VH和VL区组成，要么由Fab片段组成。两个scFv片段串联成的scFv分子是其中一种简单的形式，在双特异性T细胞衔接器（BiTE）技术中采用的就是这种形式。在这种形式中，两个scFv片段以一种灵活的方式通过连接肽段连接在一起。另外一种方法是基于双体抗体的形式。来自两个抗体A和B的可变区作为多肽链被表达出来，VHA-VLB和VHB-VLA，通过一个短肽连接在一起，促使两条链发生异源二聚化。二价双体抗体形式后来被进一步改进，转换成单链版本（scDb）和四价的二聚体衍生物（tandAb），对每种抗原有两个结合位点，还有通过二硫键稳定的变体，例如双倍亲和力靶向分子（DART）。这些分子的体积小，再加上缺乏Fc区，导致其在体内会快速发生肾清除。尽管体积小有利于组织渗透（如在肿瘤治疗中），但其血清半衰期短会影响剂量（如在频繁注射或输液中需要）。延长半衰期的方法，包括聚乙二醇（PEG）融合、类PEG多肽融合或白蛋白结合部分的融合。

BsAbs还可以通过将不同的抗原结合部分（如scFv或Fab）与其他蛋白结构域融合生成，

可进一步包含新的功能。例如，两个scFv片段与白蛋白融合，使抗体片段获得了更长的血清白蛋白循环时间。另外一个例子是基于cAMP依靠的蛋白激酶和一个激酶锚定蛋白的异源二聚化的“dock-and-lock〞方法。这些结构可以与Fab片段或者整个抗体分子连接形成双特异性抗体。

图1显示了生物技术学术界和制药行业等不同群体用于获得bsAb格式不同的策略示意图。大多数的这些格式仍在临床前评价阶段和大量可能仍旧停留在这个阶段。然而,一些格式已经开始临床开发，详见表1。临床开发中的bsAb格式的如图2所示。

免疫细胞的招募和激活

四价双特异性抗体用于T细胞招募：Trion制药

抗上皮细胞粘附分子和抗CD3的双特异性抗体——卡妥索单抗

（catumaxomab,Removab1）是第一个获得上市许可的双特异性抗体。Trion制药将卡妥索单抗作为一个三功能bsAb、一个肿瘤抗原和小鼠来源IgG2a和老鼠来源IgG2b的CD3结合混合物。它可以靶向肿瘤，通过结合T细胞受体混合物的CD3亚基来招募T效应细胞，同时可以通过结合FCγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和NK细胞。这使其

可以在卵巢癌中可杀死从而减少肿瘤细胞（图3A），阻止和减少腹水积累。作为第一代双特异性抗体，卡妥索单抗是一个由小鼠-老鼠杂交瘤表达的非人源的、小鼠-老鼠源杂合的抗体，每条臂结合不同的抗原。正确配对的异源二聚化抗体是通过分开目标分子与非所期待的单特异性老鼠源或小鼠源抗体以及错误连接的L链污染物而获得的。L链的错配也可以减少，由于老鼠L链更倾向于与老鼠H链配对，反之亦然；小鼠的H和L链也会优先配对。

卡妥索单抗是有效的，并且具有可接受的安全性，只需要很小的剂量（10-150mg）在9-13天内腹腔输液四到五次。除了被批准用于治疗恶性腹水，卡妥索单抗还被应用于卵巢癌的临床研究（二期）、胃癌（二期）以及上皮癌（一期和二期，见表1）。鉴于卡妥索单抗是老鼠-小鼠源杂合的，在大多数患者身上会出现抗小鼠IgG或抗老鼠IgG的反应；然而，其疗效并未受显著影响。

通过杂交瘤技术有一系列的bsAb产生，包括同时抗CD3和CD20或HER2，以及其他的一些肿瘤抗原，像神经节苷脂GD2和GD3。所有这些bsAb都处于临床前评估，其中有两个进入了临床试验阶段：一个是ertumaxomab(Rexomun)，通过结合HER2靶向肿瘤细胞，通过其抗CD3臂招募T细胞，目前处于治疗转移性乳腺癌临床一期阶段。另一个是Lymphomun,通过靶向结合T细胞表面的CD20抗原，通过其抗CD3臂招募T细胞，目前处于B细胞淋巴瘤患者的临床一到二期研究。

图3不同bsAb的作用机制

BiTEs招募T细胞：Amgen公司（从Micromet收购获得此技术）

鉴于Trion制药研发的招募免疫细胞的类IgG双特异性抗体是含有Fc区的，相对有更长的血清半衰期，Amgen采用BiTEs技术开发了一种概念不同的招募效应细胞的抗体形式。这些小个体是仅由抗体的单链可变区scFvs通过连接肽段连接在一起的。它们作为重组蛋白由CHO细胞表达，只含有两个抗原结合位点。其中一个靶向肿瘤相关的细胞表面抗原（比对CD3有更高的亲和力），另一个以更低的亲和力结合CD3。由于BiTEs体积更小且缺乏Fc区，其血清半衰期更短。尽管如此，它们在细胞培养中剂量低至10g/ml的状况下仍能发挥效力并诱导特异性的抗肿瘤细胞毒性（靶向裂解培养细胞）。因此，BiTEs不会被消耗，而是作为招募分子，可以在低效应分子：靶细胞比率条件下，促使靶细胞重复被T细胞裂解。

目前临床开发最深入的BiTE是blinatumomab(AMG103,MT103)，靶向在急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的CD19抗原，在好多临床前模型中都显示出了很高的清除肿瘤的效力。鉴于其效力及为了降低风险，blinatumumab应用到患者的剂量很低（低至0.005-0.06mg/m2）。药代动力学（PK；短半衰期）也要求一个适合的数周连续给药的给药方案，以确保T细胞的靶向裂解作用持续被激活。Blinatumomab目前处于针对微小残留性ALL的临床三期研究（NCT02023167）、针对ALL的临床二期、复发性ALL的临床一到二期，以

及儿科ALL的临床一期阶段。2023年12月，FDA批准了blinatumomab(Blincyto)作为治疗费城染色体阴性B细胞急性白血病的新型免疫疗法的上市申请。慢性淋巴细胞白血病（CLL）B细胞在自身T细胞存在的状况下也可以通过blinatumomab减少，对经过不同化疗的患者同样适用。Blinatumomab对非霍奇金淋巴瘤患者也显示出了肿瘤消退作用。

Micromet研发的其他一些BiTEs，靶向肿瘤相关的抗原有EpCAM,HER2,癌胚抗原（CEA），肝素A2(EphA2),黑色素瘤相关的软骨素硫化蛋白多糖（MCSP）和CD33。目前靶向EpCAM-CD3的BiTE（MT110,AMG110）正在进行大肠癌、肺癌和胃肠道癌症的临床一期研究。靶向CEA-CD3的抗体（MT111）正在进行晚期胃腺癌的临床1b研究，还有另外一个靶向前列腺特异性膜抗原PSMA-CD3的抗体正处于前列腺癌的临床1期（MT112,Bay2023112，Bayer）。

DART招募T细胞：Servier公司和Macrogenics公司

Servier公司和Macrogenics公司开发了一种双亲和重靶向的可招募T细胞的双特异性抗体（DART）。DARTs是由一种抗体的VH与另一种抗体的VL相连，其次种抗体的VH与第一种抗体的VL相连组成的类双特异性抗体（如图2），通过额外的二硫键稳定形成DART。MGD006是一种人源性双亲和重靶向（DART）分子，能够同时与白血病细胞表达的CD123抗原和T细胞表达的CD3抗原结合。该药治疗急性髓性白血病（AML）的Ⅰ期临床试验阶段2023年6月开始，作为DART候选药物的首个临床研究，具有标志性意义。MGD007用于治疗结肠癌，2023年7月已进入Ⅰ期临床试验阶段（NCT02248805）。该药也是一种人源性DART分子，能够同时识别结肠癌细胞表面的GPA33抗原和T细胞表面表达的CD3抗原。相比MGD006，MGD007融合了一个Fc区，因而具有较长的血清半衰期（如图2）。

TandAbs招募NK和T细胞:Affimed

AFM13是Affimed公司开发的能在肿瘤中招募免疫细胞的TandAbs(双特异、四价嵌合抗体)。相比上述双特异性抗体，AFM13招募的免疫细胞不是T细胞而是NK细胞。它一方面结合CD30一方面结合NK细胞和巨噬细胞上的CD16A。TandAbs是双特异性融合蛋白，含有四个结合位点，两个结合肿瘤细胞表面抗原，两个结合免疫细胞。它不含有Fc区，比整个IgGs或者类IgG双特异性抗体分子量小，但比BiTEs大，因此具有比IgGs更短但比BiTEs更长的半衰期。AFM13目前处于霍奇金病的临床一期。

AFM11是另一个TandAb，AFM11靶向CD19和CD3，CD19在多种恶性B细胞上表达，因此其用于治疗非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病，目前处于Ⅰ期临床试验阶段。

干扰受体信号，灭活信号配体

受体络氨酸激酶（RTKs），如HER家族和胰岛素样生长因子IGF受体，刺激或调理肿瘤细胞的生长，因此它们成为肿瘤治疗中的优先靶点。靶向RTK的单特异性抗体，如靶向HER1的cetuximab和panitumumab，以及靶向HER2的trastuzumab和pertuzumab，已经在肿瘤治疗中得到了广泛的应用。然而，肿瘤细胞可以通过信号通路的转换来破除这些药物对其生长的抑制，因此BsAb介导的针对两条RTK信号通路的治疗可以减少肿瘤细胞的这种逃脱机制，从而提高疗效。以类似的方式，炎症通路中的受体或配体可以用来干扰炎症前信号和治疗炎症或自身免疫性疾病。

靶向Her2+Her3或IGF1R+Her3的(scFv)2-HSA和四价-IgG衍生物(Tv-IgGs):Merrimack公司

MM-111，由Merrimack制药研制，靶向HER家族的两个成员。鉴于这个家族的四个成

员(HER1/表皮生长因子受体,HER2HER3,和HER4),不同的RTK异源二聚体包含HER1,2或3结合表皮生长因子(EGF)有关的生长因子，触发细胞内的信号级联,促进肿瘤的生长。一个是HER2，在乳腺癌中高表达30%，总生存期更短并可减少复发次数。在HER2高表达的乳腺癌中也发生了HER3的磷酸化，HER2和HER3的异源二聚体促进了乳腺癌癌症的发展。同时阻断HER2和HER3具有更好的生长抑制效应，这可以干扰HER2基因扩增的癌细胞细胞系生长，即使都是针对HER2的抗体（如trastuzumab和pertuzumab）同时作用也可以微弱地抑制配体诱导的HER3激活。MM-111对HER2和HER3有很高的特异性和亲和力，由两个对抗性的scFv片段连接而成，每一个片段有一种特异性（如图2）。其中，HER2臂是最初的肿瘤细胞靶点，而HER3臂阻断生长因子诱导的细胞信号，起到治疗作用。MM111不含Fc区，含有两个scFv，融合调整过的人血清白蛋白以扩展PK。目前其拟适应证是治疗晚期胃癌和食道癌，已进行到Ⅱ期临床试验阶段。

Merrimack开发的另一个双特异性抗体MM141，它可同时结合HER3和非HER家族的IGF-1R。选择这两个靶点是由于IGF-1R信号在好多癌症中有加强并且该信号为肿瘤细胞提供了一种逃脱机制。MM141的形式是基于改进的“Morrison-Prototype〞形式（如图2）。它有稳定的scFv结合在一个IgG分子的恒定区，含有四个结合区域，每个特异性靶点有两个结合区。目前处在晚期实体瘤的临床一期研究。

靶向HER1+HER3的双重作用Fab(DAF)-IgG：基因泰克公司

RG7597是基因泰克公司研发的同时结合HER1和HER3的双特异性抗体。将针对HER1和HER3两种特异性结合在一起，可以提高癌症治疗疗效，由于这样可以完全抑制MAPK和AKT信号通路。是一种在一个特定的可变区里建造两种特异性功能的人源化IgG。现金的基因工程、展示和选择技术联合运用使发展和分开出两种结合个体都对HER1和HER3具有良好的亲和力(分别是1.9nMand0.4nM)。Fc区的存在使这种双特异性抗体可以像正常人体IgG一样，同时可以发挥免疫效力，如ADCC。RG7597目前处于头颈癌的临床二期。

靶向HER1和c-Met的H链与正交Fab的异源二聚体:EliLilly礼来制药

LY3164530由礼来公司研制，靶点是MET和EGFR。它大致形式像IgG,是重链和两个不同的Fab（可变区和恒定区突变的）构成的异源二聚体。这生成一个“正交接口〞会导致不同的Fab片段的优先正确的组装。HER1c-MET在肿瘤生长和转移中有作用,同时干扰他们的受体信号可能会有利于单一应用的HER1或者c-MET抗体。此外,正常二价免疫球蛋白结合HER1和c-MET本身可以诱导由IgG介导触发二聚作用的受体信号,。然而,这种潜在的问题不适用类IgG形式，由于它对每个抗原只有一个结合臂。

靶向受体配体TNF+IL17和IL1α+IL1β的DVDIgG：雅培和艾伯维公司

针对受体-配体系统的应用不光在癌症领域，在炎症性疾病如类风湿性关节炎（RA）中同样适用。由艾伯维公司开发的ABT122这种双特异性抗体针对IL-17和肿瘤坏死因子(TNF)。DVD-Ig形式由一整个结合IL17的IgG和在可变区上“ontop〞上额外结合一个靶向TNF的可变区（如图2）。DVD-Ig分子具有更佳的结合亲和力和配体通道和结合两个靶点的能力，它含有恒定区（人IgG1/κ）因而血清半衰期长。目前ABT122治疗风湿性关节炎的临床试验处于I期阶段。

ABT981是雅培研发的另外一个DVD-IgG，针对IL1α和IL1β。这两个靶点都是已经证明与类风湿性关节炎有关的靶点，功能性地干扰它们可以阻断炎症前信号通过同源受体。因此，双特异性抗体同时介导的抑制作用可以发挥更大的效力。目前ABT981亦处于治疗风湿性关节炎的临床试验I期阶段。

靶向受体配体IL-17A和IL-17F或两个Aβ抗原表位的双纳米抗体：Ablynx

ALX-0761：该药由Ablynx公司研制，目前由Ablynx和默克雪兰诺共同开发。ALX-0761是一种能够同时瓦解IL-17A和IL-17F的双特异性纳米抗体，目前处于健康志愿者的Ⅰ期临床阶段。IL-17和Th17细胞与炎症和自身免疫疾病相关，鉴于IL-17A和IL-17F是此信号通路中总要的配体，同时作用于这两个配体的双特异性抗体相比单特异性抗体可以更加有效地阻断炎症反应。双特异性纳米抗体由两个不同特异性的单体VH类似物结合个体以一种二价特异性的方式融合而成。这些个体含有一个半衰期延长的加合物，而不是Fc区，来战胜潜在的PK问题（避免极短的血清半衰期）。

抗-Aβ的双特异性纳米抗体BI1034020是ALX0761抗体形式的另一个衍生物，目前处于临床一期。它由两个不同特异性的单结构域和一个PK调理部分构成，最初也是由Ablynx开发，可结合两个抗体决定簇或淀粉β肽段-Aβ肽段的抗原决定簇，而非结合两个配体。

靶向受体配体VEGFA和促血管生成素2的交织抗体：罗氏

RG7221是罗氏开发的靶向受体配体VEGFA和促血管生成素2的交织抗体。该抗体是通过一种形似IgG，一个臂可以结合每个配体的交织抗体（如图2），由于具有Fc区形似IgG,这类抗体PK性质与正常IgG一样。肿瘤血管化是肿瘤生长所必需的，受多种血管生成素因子的控制和调理，清除血管生成因子，如VEGF，可以起到治疗肿瘤的作用。然而，肿瘤可以通过其他通路来逃脱这种针对血管生成通路的抑制，因此同时作用两个或以上的信号通路可以提高抗血管生成的作用，减少逃脱机制。贝伐单抗（Avastin）的靶点是VEGF，可结合VEGF1和VEGF2来调控血管生成。促血管生成素2（Ang2）是Tie-2激酶的一个配体，通过结合其受体也可以起到调理肿瘤血管生成的作用。临床前研究说明针对Ang2和VEGFA的双特异性抗体的活性会高于其中单独一个靶点的抗体。目前RG7221处于结肠直肠癌的临床二期。

RG7716是靶向VEGFA和Ang2的另一个交织抗体，它与RG7221具有一致的大小、组成和特异性，但PK性质不同。配体（VEGFA和Ang2）驱动的血管生成不但是肿瘤生成中的问题，也存在于在湿性老年性黄斑变性（AMD）中。因此，RG7716交织抗体被研发用于眼科学，目前处于湿性AMD的临床一期。

靶向受体配体IL4和IL13的TBTI(DVD)-IgG：Serono

SAR156597：该药由赛诺菲公司研制，能同时作用于IL-4和IL-13，从而抑制它们的同源受体的信号通路，相比单独作用其中一个靶点，具有更高的抑制IL4和IL13依靠性的成纤维细胞激活活性。可能适应症为纤维化疾病，特别是特发性肺纤维化（IPF），这是一种目前治疗手段有限、成活时间很短的一种疾病。该抗体形似IgG，在重链和轻链的N端含有一个额外的V区。这种N端串联V区（TtravalentbispecifictandemIg,TBTI,四价双特异性串联抗体）的形式与DVD-IgG一样。目前处于IPF的临床一期。

靶向受体配体IL17和IL13的ScFv-IgGs：BMS-Zymogenics

同时靶向受体配体IL17和IL13的双抗体可以通过它们的受体干扰其信号通路，干扰该通路预计可减少炎症反应和细胞因子的释放，可用于治疗炎症或自身免疫性疾病。这种双特异性抗体形式含有融合了两种特异性scFv的Fc区，目前处于炎症和自身免疫性疾病的临床一期。

用于定位或预定位承载运输的双特异性抗体

用于CEA-表达细胞的放射性疗法的DNL（Fab3）：Immunomedics

BsAbs不但能用于交联蛋白、细胞、同时干扰两个靶点