免疫组化he染色fishish

免疫组化he染色fishish免疫组化he染色fishish第1页

免疫组化

1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合原理，经过化学反应使标识抗体显色剂

(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究，称为免疫组织化学。

2、咱们现阶段主要要做组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化。3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提升免疫组化阳性检出率非常有效。4、高压修复和微波修复法中常见缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mMEDTA（pH8.0）。免疫组化he染色fishish第2页6、酶标抗体系统中酶与显色剂、复染液合理选取：（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂普通用DAB、AEC,DAB显色液普通染色部位为棕黄色，AEC显色液普通染色部位为红色；而HRP系统常见复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。（2）碱性磷酸酶系统（AP）显色剂普通用BCIP/NBT、固红、固蓝。最常见是BCIP/NBT显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常见复染液为核固红，将细胞核染成红色。免疫组化he染色fishish第3页

免疫组化切片组织前期处理1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm。2、应用于光镜免疫组织化学染色切片厚度普通要求5μm左右，神经组织研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维走行。3、石蜡切片为常规制片技术，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体穿透性，染色均匀一致。4、组织固定：4%多聚甲醛固定普通1-2小时。固定后经充分流水冲洗后进行脱水包埋。5、组织脱水：主要用不一样梯度酒精进行脱水。普通情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精脱水程序，即可到达脱水要求。不过为了能使大量组织块同时进行脱水，则要求保持液体浓度以确保脱水作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以确保组织水分脱净。6、组织透明：咱们普通采取二甲苯透明，30-60min即可。免疫组化he染色fishish第4页5、石蜡切片：浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低软蜡很好,浸蜡时间1－4小时。6、冰冻切片：组织采取液氮法包埋。将未固定组织放入OCT包埋剂中对组织进行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中贮存或者对其进行切片。或者将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，降低组织含水量，再放入OCT包埋剂中进行包埋。

7、切片固定：冰冻切片、细胞切片常见固定液为4℃丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min。免疫组化he染色fishish第5页

石蜡切片免疫组化1、石蜡切片脱蜡至水。2、3%H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性，水洗，5min×3次。3、依据客户抗体要求进行修复，PBS冲洗，2min×3次。4、5-10%正常山羊血清封闭（5%BSA封闭20-30min），室温孵育20-30min。倾去血清，勿洗。5、滴加适当百分比稀释一抗或一抗工作液（PBS配制），37℃孵育1-2小时或4℃过夜。（室温20-30min，再放于37℃孵育20-30min）6、PBS冲洗，2min×3次。7、滴加适当百分比稀释生物素标识二抗，37℃孵育10-30min。8、PBS冲洗，2min×3次。9、滴加即用型SABC，37℃孵育10-30minPBS冲洗，5min×4次。10、显色剂显色（DAB或AEC）。11、自来水充分冲洗，复染（苏木素），脱水透明，封片。返回

B免疫组化he染色fishish第6页石蜡切片免疫组化DAB显色免疫组化he染色fishish第7页

血涂片，细胞，冰冻切片免疫组化1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS冲洗5min×3次。3、30%过氧化氢1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗2次。4、其余步骤和石蜡切片免疫组化4-11步相同。注：假如冰冻切片直接染色结果不理想时，能够参考石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片3-11步相同。免疫组化he染色fishish第8页

石蜡切片荧光免疫组化1、石蜡切片脱蜡至水。

2、与石蜡切片免疫组化3-8步骤相同。3、加入SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗，5min×4次。4、抗荧光萃灭封片液封片，荧光显微镜观察。免疫组化he染色fishish第9页

冰冻切片荧光免疫组化1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS冲洗5min×3次。3、5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。4、滴加适当百分比稀释一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。5、PBS冲洗，5min×3次。6、滴加适当百分比稀释生物素标识二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素标识二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。7、PBS冲洗，5min×3次。8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗5min×3次。9、抗荧光萃灭封片液封片，荧光显微镜观察。免疫组化he染色fishish第10页

细胞爬片免疫组化1、取出培养皿，用PBS漂洗2min×2次.2、4℃冷丙酮或4%多聚甲醛固定细胞爬片，室温10-30分钟。PBS漂洗2min×3次。0.5%TritonX-100室温处理20min。PBS洗2min×3次，3%过氧化氢室温处理15min，PBS洗2min×3次。3、血清封闭：室温10-30分钟，倾去。4、一抗：37℃1小时或4度过夜5、0.1MPBS洗三次------每次三分钟。6、对应生物素化二抗37℃30-40分钟。7、0.1MPBS洗三次------每次三分钟。8、链酶卵白素-碱磷酶复合物或过氧化物酶标识链酶卵白素37℃40min。9、NBT/BCIP或DAB显色，核固红或苏木素复染。10、切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封片；免疫组化he染色fishish第11页注意事项：1、良好细胞爬片是进行免疫组织细胞基础，要取得良好细胞爬片须注意以下：（1）对于粘附分子较少细胞爬片时间要达5天以上，这么细胞爬片才较牢靠，冲洗时不易脱片；（2）接种细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保留于4度冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、TritonX-100（曲拉通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要成份脂质，对于抗原表示在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表示在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。免疫组化he染色fishish第12页

免疫组化中常见固定液1.冷丙酮可用于普通免疫组化染色。将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强挥发性，注意将含有丙酮和爬片器皿盖严，预防其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保留。2.多聚甲醛(常见4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。主要检测组织内一些性能娇弱抗原尤其是细胞表面抗原，比如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保留3.95％乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保留很好。缺点：醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保留效果较差，使蛋白变性作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保留4.甲醛(福尔马林)应用最广优点：形态结构保留好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成网格结构可能个别或完全掩盖一些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性染色结果。返回免疫组化he染色fishish第13页

HE染色

苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)是石蜡切片技术里常见染色法之一。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基础、使用最广泛技术方法。

HE染色原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很轻易与带正电荷苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。伊红是一个化学合成酸性染料，在水中离解成带负电荷阴离子，与蛋白质氨基正电荷阳离子结合使胞浆染成红色或粉红色，与蓝色细胞核形成鲜明对比。免疫组化he染色fishish第14页石蜡切片HE染色步骤：1、脱蜡水合。2、蒸馏水洗5min×3次。3、苏木素染液染色，镜下控制染色时间。4、水洗玻片上多出染液，0.5-1%盐酸酒精分色数秒。5、流水冲洗15-30s，细胞核呈蓝色。6、0.5%伊红染液染色1-5min。蒸馏水浸泡5min。7、风干，封片。免疫组化he染色fishish第15页细胞爬片HE染色1、取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。2、样品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次2min。3、其余步骤和石蜡切片3-7步相同。冰冻切片HE染色1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福尔马林15mL，95%乙醇80mL，冰乙酸5mL)2、其余步骤和石蜡切片2-7步相同。染色结果：细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它部位呈深浅不一样红色。免疫组化he染色fishish第16页返回免疫组化he染色fishish第17页

常见特殊染色一、弹力纤维染色1、弹性纤维主要由弹性蛋白（一个黄色硬蛋白，它是黄色弹性纤维组织主要成份，干燥时易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性）组成。新鲜时它呈黄色，固又称为黄色纤维。弹性纤维较细，直径0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交织成网。它富有弹性，轻易拉长，但不能拉到超出它极限，外力除去后又恢复原状。2、弹性纤维染色临床应用1）用于区分正常动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层情况，如动脉粥样硬化时各类改变。2）用于区分观察各种疾病对弹性纤维影响及改变，如原发性或继发性高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症。心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解弹力纤维。3）用于弹力纤维性假黄瘤诊疗。该病镜下见真皮中下部结缔组织变性，呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法能够判别。免疫组化he染色fishish第18页3、弹性纤维染色方法：维格特氏雷锁辛品红法、Gomori‘s醛品红法、地衣红技术、费尔霍夫氏酒精苏木素技术。二、Masson染色Masson染色,用于显示组织中纤维染色方法之一。普通Masson染色用是三色法，苯胺蓝染液使胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如光绿液染色为绿色)，Masson丽春红酸性复红液使胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，Regaud氏苏木精染液使细胞胞核黑蓝色。三、网状纤维染色1、网状纤维在组织化学上反应网状纤维主要成份是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是轻易区分。网状纤维是分支纤细纤维。VanGieson氏染色不显色或微红色。PAS反应展现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用VanGieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色。银浸染为黄色或棕黄色。免疫组化he染色fishish第19页2、临床应用1）可用于区分癌和肉瘤诊疗。比如：网织细胞肉瘤和转移于淋巴结内未分化癌，这二者在HE染色切片都较难区分，前者可产生网状纤维，后者不产生网状纤维。鼻咽部活柱，应将网染作为常规，给予使用，可增加诊疗准确性。2）可用于区分血管内皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它瘤细胞在网状纤维膜内，而血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤瘤细胞可见较多网状纤维。3）可用于神经系统方面肿瘤区分。如：交感神经母细胞，脑髓母细胞瘤，这些肿瘤形态有时象肉瘤，但银染时，神经系统网染为阴性，不过脑原发性肉瘤有较多网状纤维。4）可用于观察癌组织发生发展过程。如：原位癌，可见有完整基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏基底膜。5）可用于区分淋巴系统方面肿瘤。如：淋巴肉瘤和网织细胞肉瘤，前者瘤细胞间网状纤维比正常稍降低，后者则比正常时增多。6）可用于急性骨髓纤维化判别诊疗，该病网状纤维增多，纤维能够是致密和融合性。胶原纤维染色通常呈阴性，尽管偶然有病例可能显示胶原纤维化。免疫组化he染色fishish第20页四、VanGieson染色1、结果：胶原纤维染成鲜红色；肌纤维染成黄色；红细胞染成黄色；细胞核染成蓝黑或灰色。2、临床应用：胶原纤维发生病变如坏死或透明变性时，它与淀粉样物在HE染色时被染为粉红色，不好区分。应用V.G染色法，能将胶原纤维染为粉红色，而淀粉样物将被染为黄色。返回免疫组化he染色fishish第21页

敏感性加强型原位杂交（AP）

原位杂交(ISH)是一个可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA技术，此方法原理是由DNA或RNA序列与互补标识单链DNA/RNA探针结合形成标识双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调整、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。敏感性加强型原位杂交（AP）仅适应于地高辛高效标识寡核苷酸探针。免疫组化he染色fishish第22页一、培养细胞和冰冻切片1、培养好细胞用0.1MPBS洗2min×3次。2、培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛，室温固定20-30min。蒸馏水洗，干燥后-20℃保留。3、暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化5-120s，0.5MTBS洗涤5min×3次，蒸馏水洗涤1次。4、预杂交5、杂交6、杂交后洗涤7、滴加封闭液。37℃30min8、滴加生物素化鼠抗地高辛。37℃60min免疫组化he染色fishish第23页9、0.5MTBS洗涤5min×4次。10、滴加SABC-AP37℃20min。0.5MTBS洗涤5min×4次。11、BCIP/NBT显色，核固红复染。13、风干，水溶性封片剂封片。二、石蜡切片1、常规脱蜡至水。2、3%过氧化氢室温处理10min，蒸馏水洗5min×2次.3、暴露暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化10-30min，0.5MTBS洗涤5min×3次，蒸馏水洗涤1次。4、其余步骤和冰冻切片4-13步相同。免疫组化he染色fishish第24页三、结果观察阳性细胞胞浆着色呈深蓝色或蓝紫色，细胞核着色呈红色（图片）四、注意事项

1、石蜡切片水合时所用不一样浓度酒精用0.1%DEPC水配制。2、缓冲液配制时要用灭菌水来配。3、试验过程中所用3%柠檬酸需现配现用。

4、在冰冻切片原位杂交试验中最主要组织及细胞及时固定，并在固定液中加入0.1%DEPC水处理，以抑制RNA酶对mRNA分解作用。

5、石蜡切片脱蜡时要用新二甲苯浸泡，不能要以前浸泡过切片二甲苯脱蜡。返回免疫组化he染色fishish第25页microRNA原位杂交图片返回免疫组化he染色fishish第26页

荧光原位杂交（FISH）

荧光原位杂交技术(florescenceinsituhybridization，FISH)是一个利用荧光信号对原位杂交样本进行检测技术。它将