基因工程目的基因的获取

基因工程目的基因的获取1第1页，共69页，2023年，2月20日，星期四第四章目的基因的获取第一节基因组DNA片断化第二节化学合成目的基因第三节目的基因的保存和扩增第四节目的基因的分离和扩增第2页，共69页，2023年，2月20日，星期四第四章目的基因的获取目的基因：研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。第3页，共69页，2023年，2月20日，星期四目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系第4页，共69页，2023年，2月20日，星期四第5页，共69页，2023年，2月20日，星期四化学合成法

cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应直接分离法目的基因的制备第6页，共69页，2023年，2月20日，星期四第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法二、随机片断化第7页，共69页，2023年，2月20日，星期四第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切第8页，共69页，2023年，2月20日，星期四由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene第9页，共69页，2023年，2月20日，星期四二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。限制性内切酶的选用原则第10页，共69页，2023年，2月20日，星期四1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）第11页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。第12页，共69页，2023年，2月20日，星期四第二节化学合成目的基因一、目前常用的方法二、化学合成DNA片断的组装三、寡聚核苷酸化学合成的优点第13页，共69页，2023年，2月20日，星期四第二节化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。第14页，共69页，2023年，2月20日，星期四①保护dNTP的5’端-OH或3’端P③用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。第15页，共69页，2023年，2月20日，星期四（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。第16页，共69页，2023年，2月20日，星期四原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法第17页，共69页，2023年，2月20日，星期四固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,最后脱保护。固相支持物固相支持物C第18页，共69页，2023年，2月20日，星期四化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）第19页，共69页，2023年，2月20日，星期四T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链第20页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物第21页，共69页，2023年，2月20日，星期四1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。第22页，共69页，2023年，2月20日，星期四化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列第23页，共69页，2023年，2月20日，星期四第24页，共69页，2023年，2月20日，星期四DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第25页，共69页，2023年，2月20日，星期四第三节目的基因的保存和扩增一、基因文库的构建二、cDNA文库的构建三、文库的查询（screening）第26页，共69页，2023年，2月20日，星期四将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第三节目的基因的保存和扩增第27页，共69页，2023年，2月20日，星期四（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb第28页，共69页，2023年，2月20日，星期四断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：第29页，共69页，2023年，2月20日，星期四（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。第30页，共69页，2023年，2月20日，星期四各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾第31页，共69页，2023年，2月20日，星期四第32页，共69页，2023年，2月20日，星期四限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因组文库第33页，共69页，2023年，2月20日，星期四酵母人工染色体基因组文库的构建第34页，共69页，2023年，2月20日，星期四4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）第35页，共69页，2023年，2月20日，星期四例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第36页，共69页，2023年，2月20日，星期四1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第37页，共69页，2023年，2月20日，星期四（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。3.cDNA文库的特点第38页，共69页，2023年，2月20日，星期四4.构建cDNA文库的一般步骤mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库逆转录酶载体受体菌复制第39页，共69页，2023年，2月20日，星期四4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。第40页，共69页，2023年，2月20日，星期四分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）第41页，共69页，2023年，2月20日，星期四OligodT纤维柱层析法AAAAAAAAAAAAOligodTOligodTOligodT第42页，共69页，2023年，2月20日，星期四第43页，共69页，2023年，2月20日，星期四反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第44页，共69页，2023年，2月20日，星期四用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱第45页，共69页，2023年，2月20日，星期四剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成第46页，共69页，2023年，2月20日，星期四④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’第47页，共69页，2023年，2月20日，星期四第48页，共69页，2023年，2月20日，星期四这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。第49页，共69页，2023年，2月20日，星期四mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物第50页，共69页，2023年，2月20日，星期四在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第51页，共69页，2023年，2月20日，星期四第52页，共69页，2023年，2月20日，星期四第53页，共69页，2023年，2月20日，星期四第54页，共69页，2023年，2月20日，星期四6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n第55页，共69页，2023年，2月20日，星期四

基因组DNA克隆cDNA克隆第56页，共69页，2023年，2月20日，星期四三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第57页，共69页，2023年，2月20日，星期四第四节目的基因的分离和扩增二、PCR扩增获得目的基因一、目的基因的分离第58页，共69页，2023年，2月20日，星期四第四节目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第59页，共69页，2023年，2月20日，星期四纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR第60页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）第61页，共69页，2023年，2月20日，星期四从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。第62页，共69页，2023年，2月20日，星期四AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCRcDNA文库第63页，共69页，2023年，2月20日，星期四3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的锚定引物Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’第64页，共69页，2023年，2月20日，星期四（2）12种锚定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’