梅毒讲义(培训讲义)

梅毒讲义梅毒的现状及定义一、梅毒的现状1、近年来我国严峻的梅毒流行形势（梅毒实验室检测不规范现状）。2、今年卫生部出台梅毒10年控制规划（梅毒血清学检测、新方法、新技术的应用性评估）3、目前我国仅对首次就诊的孕产妇制订了梅毒筛查方案，即：首先采用非梅毒螺旋体抗原血清学试验或梅毒螺旋体抗原血清学试验之一进行初筛，当筛查结果为阳性时，需用另一类试验进行复检。对一般人群尚无明确的筛查诊断流程。二、梅毒的定义梅毒是一种全球分布的系统性性传播疾病。梅毒的病原体是苍白螺旋体（Treponemiapallidum，TP）。人是梅毒的唯一传染源，主要传播途径主要有性传播、血液传播和母婴传播3种，可侵犯人体全身器官，临床表现分为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒，既能产生各种各样的症状和体征，又可多年无症状而呈潜伏状态，对人类健康危害极大。梅毒螺旋体的生物学特性1.长度为8μm～20μm，平均8μm～10μm，直径<0.2μm,有6～12个螺旋。2.因其透明不易染色，故称为苍白螺旋体。3.梅毒螺旋是一种小而纤细的螺旋状微生物。4.梅毒螺旋体的特征是螺旋体整齐而规则，折光性强，较其他螺旋体亮。5.运动缓慢而有规律，具有三种特征性运动方式：常见是围绕其长轴旋转前后移动；其次是全身弯曲如蛇行；少见的是伸缩其螺旋间距而前进6.梅毒螺旋体至今还不能在人工培养基上生长繁殖，目前只能将其接种到兔睾丸内增殖、传代和保存。以横断分裂的方式进行增殖，世代时间为30小时～33小时。7.梅毒螺旋体在体外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒剂如汞剂、石炭酸、乙醇等很容易将其杀死。在41℃～42℃时经过1小时～2小时也可将其杀死。8.低温（-70℃～-196℃）下可保存数年并保持其形态、活力及毒性。标本的采集与处理所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作梅毒标本采集

梅毒的实验室诊断主要有病原体检测和血清学检测方法，各期梅毒的检测方法及部位见下表。临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查二期梅毒皮损、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液、脑脊液血清学检查神经梅毒血液、脑脊液血清学检查血液

血清标本根据需要，用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5ml，室温静置1-2小时（或37℃静置30分钟），待血液凝固、血块收缩后，3000r/min离心10-15分钟，分离新鲜血清，备用。也可采用保存于2-8℃或-20℃的血清。溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。血浆血浆标本根据需要，用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5ml，轻轻颠倒混匀8-10次，3000r/min离心10-15分钟，分离血浆，备用。血库血浆以及EDTA抗凝血浆同样可以用于梅毒血清学实验（一般仅用于RPR实验，），但易出现假阳性反应（需用血清复试），如用其他抗凝剂应首先评价后再用。末梢全血消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂，1岁以下儿童采用足跟部）。一次性采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液，立即用于检测。皮损部位组织液用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗视野显微镜检测，或取渗出液直接涂片，用于镀银染色试验。用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，刮取渗出液，加入有DNA保存液（1ml/管）的标本管中，备用。淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结，注入0.3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片后立即进行暗视野镜检或备用。脑脊液

操作由专业人员进行，一般用腰椎穿刺术获得。患者侧卧于硬板床，两手抱膝紧贴腹部，头向前胸屈曲，使躯干呈弓形，以髂后上棘连线与后正中线的交点为穿刺点，相当于第3-4腰椎棘突间隙，消毒处理后，用2%利多卡因自皮肤到椎间韧带作局部麻醉。术者用左手固定穿刺皮肤，右手持穿刺针以垂直背部方向缓缓刺入，针尖稍斜向头部，成人进针深度约4-6cm，儿童约2-4cm。当针头穿过韧带与硬脑膜时，有阻力突然消失落空感，此时可将针芯慢慢抽出，即可见脑脊液流出，至于合适的容器中，备用标本接收的标准

核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒并做记录。检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、脂血以及黄疸等情况。如果样品污染或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送检科室。对不合要求的标本，可以拒绝接受。梅毒的实验室检查

病原体检查梅毒螺旋体暗视野显微镜检查

梅毒的血清免疫学检查梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）梅毒螺旋体颗血球凝集试验（TPHA）梅毒酶联免疫吸咐试验（TP-ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒快速检测（TP-RT）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）。梅毒的核酸检查可对血浆、血清、皮损部位组织液、淋巴穿刺液及脑脊髓液等标本的梅毒螺旋体核酸采用PCR进行检测病原体检查方法即梅毒螺旋体检查，采用暗视野显微镜检查或直接免疫荧光试验(directfluorescentantibodytest，DFA)，在显微镜下观察梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式。该方法是诊断早期现症最直接的方法，但由于受到患者用药、检测仪器状态和检测人员技能等条件的制约，本方法实际检出率并不高。未检测到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。本方法费时费力，也不适用于梅毒的大规模筛查。血清免疫学检查方法1

1、非梅毒螺旋体抗原试验检测患者血清中宿主针对机体组织破坏后暴露的脂抗原或者螺旋体表面的脂质产生的非特异性抗类脂抗原的抗体(反应素)。检测方法包括：快速血浆反应素环状卡片试验RPR)；甲苯胺红不加热血清(TRUST)；性病研究实验室试验(VDRL)；不加热血清反应素试验(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。由于在治疗过程中反应素滴度可呈动态变化，非梅毒螺旋体抗原血清学试验常用于临床疗效观察、复发或再感染的检查。同时，由于该方法操作简便、快速，成本低，特别适合基层应用和人群调查。此类方法的缺点是反映不出既往感染，并且受其他疾病影响较大，易产生假阳性结果（二）血清免疫学检查22、梅毒螺旋体抗原血清学试验目的检测梅毒螺旋体IgG、IgM抗体。检测方法包括：梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）梅毒螺旋体颗血球凝集试验（TPHA）梅毒酶联免疫吸咐试验（TP-ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒快速检测（TP-RT）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）。梅毒螺旋体抗原血清学试验的共同优点是特异性强，可以作为非梅毒螺旋体抗原试验初筛阳性标本的复检或确证试验，但是，由于感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者长时间甚至终生阳性。所以这些方法不能区分既往感染和现症感染。亦不能作为疗效观察的指标。甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）

原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对感染早期被损害的自身细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放脂类物质做出免疫应答，在3-4周内可产生抗类脂抗原的抗体（亦称为反应素）。这种抗体在体外可与心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原（0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.90%胆固醇）发生抗原-抗体反应。心磷脂、卵磷脂和胆固醇都是醇溶性脂类，遇水形成胶体溶液。当含有反应素的梅毒血清与之混合时，即粘附在胶体颗粒的周围。经摇动、碰撞，形成抗原抗体复合物，出现凝集颗粒，即为阳性反应。甲苯胺红不加热血清试验即在抗原中加入甲苯胺红颗粒作为指示物，与待检血清（浆）中的反应素结合，形成肉眼可见的红色絮状物。血清不需灭活，肉眼可观察结果仪器耗材TRUST试剂盒水平旋转仪：要求旋转环状直径为2cm，转速为（100±2）r/min，并带有计时器和保湿盖）无菌生理盐水（0.9%）检测流程定性试验试剂准备：检测前将试剂盒置室温预温30分钟加标本：吸取50μl血清（浆）置试验卡片圈中，并均匀地涂布在整个卡圈内。不能将标本溢出环圈外面。加抗原：将抗原轻轻摇匀，在每个标本圈中，用专用滴管针头垂直滴加1滴（60±1滴/ml，约17μl/滴）抗原,不需要手工混匀。反应：将卡片置水平旋转仪上，建议罩上保湿盖，（100±2）r/min旋转8分钟。从旋转仪中取出卡片后立即在亮光下用肉眼观察结果。用手轻微的旋转或倾斜卡片可有助于弱阳性和阴性标本。定量实验实验卡片准备：在卡片中圈1到圈4中分别标上1:2，1：4，1：8，1：16稀释液准备：在圈1到圈4中加入50μl生理盐水，勿将盐水液滴涂开。标本稀释：吸取50μl血清（浆）于圈1中，用移液器来回吸放5-6次已混合圈1中的生理盐水和标本，但要避免产生气泡。从圈1（1:2）中移取50μl到圈2（1：4）用上述同样方法混合后依次稀释至圈3（1：8）和圈4（1：16）。混旋后从圈4中弃去50μl。依次从圈4-圈1将不同稀释度的标本涂布整个圈内。加抗原等以下实验步骤同定性试验的2-4。如阳性反应滴度大于1;16,则继续稀释以测定最高稀释反应滴度。TRUST试验结果梅毒微量TRUST卡片试验结果判读阳性反应：圆圈内出现中或大的红色絮状物，液体清亮；弱阳性反应：圆圈内出现小的红色絮状物，液体混浊；阴性反应：圆圈内仅见炭颗粒集中于中央一点或均匀分散结果报告定性试验：出现凝集反应报告阳性，不产生凝集反应报告阴性。定量实验：出现凝集反应的血清最高稀释倍数为抗体滴度，结果报告滴度为1：X，X依次为1、2、4等稀释倍数。临床意义

梅毒螺旋体一旦感染人体后产生抗类脂抗原的抗体，未经治疗可长期存在。经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性，早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，TRUST抗体滴度可下降2个稀释度，6个月可下降4个稀释度，一期梅毒一般约1年后可转为阴性，二期梅毒2年后可转为阴性。但晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。TRUST定性试验结果可用于现症梅毒诊断。TURST定量试验结果可用于疗效观察和判愈。注意事项

生物学假阳性：非梅毒螺旋体抗原血清学试验采用的抗原为心磷脂、卵磷脂和胆固醇的混合物，所检测的抗心磷脂抗体易见于其他多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕的妇女等。因此该类反应会出现假阳性反应。所以该类试验阳性标本需进一步采用梅毒螺旋体抗原血清学试验（如TPPA、ELISA）等复检，以排除生物学假阳性，确认是否为梅毒螺旋体感染。前带现象：只对早期梅毒患者进行非梅毒螺旋体抗原血清试验时，有时血清中存在高浓度的抗体，导致抗原抗体浓度不匹配，出现弱阳性、不典型或阴性反应的结果，此时需将血清稀释后再进行试验，可出现阳性结果。该现象称为前带现象。梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(酶联免疫法）本试剂盒采用双抗原夹心法酶联免疫吸附试验原理。在微孔条上预包被梅毒螺旋体抗体的基因重组

抗原．配以酶标记抗原及TMB显色剂等其它试剂．检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体预期用途

本试剂盒定性检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。适用于血液的筛查及临床梅毒螺旋体感染的

辅助诊断。

主要组成成份

1．TP酶标板

2．TP阳性对照

3．TP阴性对照

4．TP酶标试剂

5浓缩洗涤液

6．显色剂A液

7．显色剂B液

8终止液

9自封袋

10封板膜储存条件有效期及适用仪器

试剂盒于2～8C避光保存：有效期为12个月。

加样器、温箱．洗板机，含波长450nm的酶标仪。

样本要求

1本试剂使用样品为人血清或血浆．含有EDTA．柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验

2不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物、重度溶血的样品。

3．样品中应无微生物．可在2～8。C储存1周．长期储存应低温冻存，避免反复冻融。

4使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。

检验方法

1配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。

2-编号：将样品对应微孔板按序编号．每板应设阴性对照3孔．阳性对照2孔和空白对照17L。f用

双波长检测，可不设空白对照孔)。

3．加样分别在相应孔中加入待测样品或阴性、阳性对照100p4．温育用封板膜封板后．置37±1。C温育60±2分钟。

5洗板：小心揭掉封板膜．用洗板机洗涤5遍．最后一次尽量扣干。

6加酶每孔加入酶标试剂100“l，空白孔除外。

7．温育用封板膜封板后，置37±1。C温育30±1分钟。

8．洗板操作同步骤5。

9．显色：每孔加入显色剂A，B液各50uI．轻轻振荡混匀，37土1~C避光显色30土1分钟

10．测定：每孔加终止液50u1．轻轻振荡混匀．10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处

(建议用双波长450nm／600～650nm)．用空白孔调零点后测定各孔A值参考值和检验结果的解释【参考值】

临界值(CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔A均值NC+018。

【检验结果的解释l

1．阴性对照孔A值≤0．10．阳性对照孔A值≥0．80。否则实验无效。

2若有1孔阴性对照A值大于0．1应舍弃．若两孔或两孔以上阴性对照A值大于01，应重复实验。

3阴性判定

样品A值<临界值(CUTOFF)者为TP阴性。

4阳性判定样品A值≥临界值(CUTOFF)者为TP阳性(注意初试阳性应重新取样双孔复试)。

局限性【检验方法的局限性】

1．本试剂检测的阳性结果必须结合临床信息进行分析。

2．由于方法学原理的限制，本试剂检测结果阴性并不排除梅毒螺旋体感染的可能。

3本试剂为定性试剂．不能作为定量试剂使用。

4本试剂仅用于人血清或血浆样品的检测。

注意事项

1．本品仅用于体外诊断操作应按说明书严格进行。封板膜不能重复使用，不同批号酶标板、酶标

试剂和阴性、阳性对照不可混用．不能与其它厂家试剂混用。

2．避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。

3使用前请将试剂平衡至室温（平衡30分钟以上)．实验前将试剂轻轻振荡混匀，使用后立即放回

2～8C。未用完的微孔板条与干燥剂一起用自封袋密封2—8C保存。过期试剂请勿使用。

4加液时必须用加样器．并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组份时．应更换加

样器吸头和加样槽，以防出现交叉污染。

5．洗涤时各孔均需加满洗液．防止孔内有游离酶不能洗净。使用洗板机应设定30～60秒浸泡时间。

在洗板结束后．必须立即进行下一步．不可使酶标板干燥。避免长时间的中断实验步骤，以确保每

孔实验条件的均一。

6．结果判定必须以酶标仪读数为准。读取结果时．应擦干酶标板底部．且孔内不能有气泡。不要触

碰孔底部的外壁，指印或划痕都可能影响板孔的读值。

7．所用样品．废液和废弃物都应按传染物处理。终止液为硫酸．使用时必须注意安全。

8．显色时必须先加显色剂A液后再加显色剂B液．以免显色过低。

9．由于ELISA反应原理的限制．本试剂检测阴性并不排除TP感染的可能。检测的阳性结果，必须结

合临床信息进行分析。

梅毒血清反应的假阳性反应（1）梅毒血清反应假阳性的分类①技术性假阳性反应由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。②生物学假阳性反应是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性（2）急性生物学假阳性反应很多非梅毒螺旋体感染性疾病，如风疹、水痘、传染性单核细胞增多症、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亚急性细菌性心内膜炎、活动性肺结核、丝虫病和沟端螺旋体病等。（3）慢性生物学假阳性反应可持续6个月以上或数年，甚至终生。梅毒血清学试验的结果解释

血清试验结果临床意义USRRPRTRUSTVDRLTPHATPPAFTA-ABSELISA一一一排除梅毒,或一期梅毒的早期或艾滋病患者合并梅毒+++现症梅毒﹙梅毒孕妇所生的婴儿除外﹚+一一生物学假阳性一++早期梅毒经治疗后

梅毒实验室操作要求

1．实验室要求清洁明亮，温度保存在23～29℃。

2．仪器设备制定详细的操作说明书，定期维护。

3．玻璃器皿或耗材要清洁干净。

4．试验操作要适合工作需要，操作人员要持证上岗。

5．操作规程要确实可行，不得随意改变。

6.认真精确操作标本和试剂，包括各种移液器和所操作的用具量的准确。梅毒实验室操作要求7．定期检查说明书，操作保持与说明