浙大微生物大实验报告

22摘：本验以土壤中的微生物作为原材,根据微生物各自的生长特点，配制不同成分的微生物培基。将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上培养，在分离出相应微物,对其进行进一步的纯化，然后观察其形态特征，并通过微生物的生理生化反应对其种类进行鉴,后研究环境条件对微生物生长的影响。关字培基分离纯，鉴定，环境条件一实材分细真放菌的料牛膏白胨化钠脂铃薯糖可性淀粉、KNO3、FeSO4·7H2O等。鲜土壤；培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基10mL装；试剂：链霉素液、0.5％重铅酸钾液。、细、菌放菌化鉴的料菌种：肠杆菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌，前实验分离的未知菌；培养淀粉培养基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培基；试剂：碘液菌：枯草杆菌斜面；灵杆菌菌液；黑曲霉斜面。培养基采用：牛肉膏蛋白胨斜面养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养（10mL)铃薯蔗糖培养（10mL)淀粉琼脂培养（10mL药:2.5%碘酒，％精0.1％HgCl,5石炭酸。二实步1分离细菌、菌、放菌的步骤（、养配l.培基配制的一般方法和步骤（1)称量:按照培养基配方，正称取各种原料放于搪瓷杯中。（2溶化：在搪瓷杯中加入所水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水用玻棒搅匀，加热溶解。（3）调pH值调pH也以在加琼脂后再调,1NaOH1HCl调pH，用pH试对照。（4加琼脂溶化，在琼脂溶化程中，需不断搅拌,并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量时间短不必补水。(5)分装在斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高／5特注不要使培养基粘污在(瓶口以免浸湿棉塞，引起污.（6包扎成捆、挂上标签。培基分装好后,塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。（7灭菌备用。灭菌后如需制斜面的，应在下磅后取出摆成斜面见—1养基经灭菌

后，必须放3℃恒温培养箱中养24h如确无菌生长、方可使用。2．三种培养基的配方及具体配方法（1牛膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养)。配方：牛肉膏3g琼脂20g

蛋白胨5g自来水000mL

氯化钠gpH7.2~7灭菌l。05kg／cm2，25～30min本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30牛肉膏、50％白胨、30％化钠。以配制00mL培基为例。吸取3％牛肉膏2mL；50％蛋白2mL；30氯化钠mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中,然后用自来补足到00mL.用玻棒搅匀，在电炉上稍加,调至7.4加琼4g,加热熔化,用玻棒不断搅，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管装带有棉塞的无菌试管，装1的管高度共12支，作斜面培养基、用铝试管帽的里10mL约试管高度的1以上,用作分离时倒平用。分装完毕，1支一捆，用防纸包扎成捆（6—3挂上标签，灭菌备用。（2马薯(或豆芽汁）蔗糖或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基配方：去皮马铃薯或豆芽）200g琼脂20g

蔗糖（或葡萄糖20gpH天

自来水000mL灭菌（含蔗糖（葡萄糖0。1kg/cm230min制备方法配200mL培养基为例取上皮马铃4，成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加200mL，电炉上加热煮10min，4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯,滤液加水补足200mL然后加蔗糖g，琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。（3).淀琼脂培养基（高氏一Gause’I)用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方：可溶性淀粉20.0gMgSO·7H0.5g琼脂20g

KNO31.0gNaCl0。5g自来水000mL

KHPO0。5gFeSO0。01g灭菌1。05kg/cm230min

制备方法配制（以配200mL)培基为:吸取配方液：1％K2HPO410mL;1O10mL％NaCl10mL7H2O0.02mL．加水补足至200mL,电炉上加热。用另一只搪瓷杯称取可溶性淀4g，从2中取少量加入淀粉中,用玻棒调成糊，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至加琼脂4g，热至琼脂完全溶化为止，热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。3。无水的制备无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准.100mL三角瓶（装有玻璃珠,自来水5mL,管中装mL来水塞棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。二）离养生常器的备1.清一些玻璃仪:如三角瓶,培养皿、吸管等。2.棉的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿,需棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞吸管上部也要塞入棉花,在管口1—2mm处，解剖针塞入少许棉（约-1.5cm长以防止细菌吸入中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。3.包培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露以保证无菌状态,为此干热灭菌先用旧报纸包装妥当（见示范组学包培养皿只（一包吸管的包装将塞好棉花的吸管,放4～5cm宽长纸条的一端约成45°角左右折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎来。上端剩余纸条折打结，准备灭菌。（)生的离1。用释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。（1）制备土壤稀释液无菌操作过程见教师示范。A。取壤g，放入装45mL无菌的三角瓶中，振荡0min,即为稀释10—1的土壤悬液。B.另装有9mL无菌试5支，用记号笔编10-2、10-3、10-4、10取稀释成0—1壤液，振荡后静止0。5min,用菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10’的无菌水的试管,并在试管轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即10-2壤稀释液。同法10—2的管中吸1mL稀液加入编号为10-3的菌水试管中混后即10—3壤稀释液依连续稀释10-4、10—5、10-6土稀释液

在土壤稀释过程,以用一支吸管由浓到稀，稀释到,稀释方法见图7-1。图检样稀释方法（2每取无菌培养2付即个同学做一只学号单号学生用0—5稀释度液双号学生用0-4稀释度液。①先在无菌培养皿底部贴上标,注明分离菌名、稀释度、组别、班级。②取另一吸管以菌操作法吸10-410—5土壤稀释1加无菌培养皿的一边在的另一边加入2滴5000U/mL的霉素液。此时严防两液相混。③取已融化在水浴锅中保5左右的马铃薯蔗糖琼脂培养2管10mL装一管倒一皿不手为准倒上述培养皿（见图7-2转动培养皿使菌液链素液培基充分混匀铺平底放在平坦的桌面,凝固后翻培养血，～30oC恒培养5。观察真菌菌落形态以及计数菌落数。并计算出1g土壤真的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的释倍数即得（3）挑取单个菌落接种到外面养基上作纯化和性能测,若不纯，需要继续分离。2。用板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上①每组取无菌培养皿付每个同学各做一只在养皿底部贴上标,注明分离菌名、稀释度组别、班级。②以无菌操作法先在培养皿中加0％铅酸钾溶2取已融化的淀粉琼脂培养2管分倒入2付培养皿中，轻轻转动培养,培养基与重铅酸钾充分混铺平，制成平板。③待平板凝固后，另取一支吸管吸1—3单学号学生）10-4（双学号学生)稀释液。2mL土稀释液放在平板上.④取无菌三角玻,把上述稀释液在平板表面涂抹均(见图—4时不要弄破平,以免响菌落的生长。翻转培养皿，28℃~30条件下培～7d,观察放线菌菌落形态及计数菌落，并算每g土壤中放线菌的数量（方法同上.⑤挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯再移植或纯,直至得到纯培养为止。

3。用板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液的制备同上（1)组取无菌培养皿两付同法在培养皿底部贴上标签。取已融化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒无菌培养血中，制成平板。(2）板凝固后,用接种环取相的菌液一环10—510-6在平板上划线（教师作示范）①连续划线法将取有样品的种环在平板培养基表面作连续划图—5勿破培养基.线完毕后，倒置8oC～30oC温培。②分区划线法接种环以无菌作挑取土壤稀释环,先在平板培养基的一边作第1次平行划线—条再动培养皿约0”角,并接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过1次划线部分作第次平行线，再用同法通过第次行划线部分作第3平行划线和通过第3次平划线部分作第4次行划线(见7-5）划线完毕，盖上皿,倒于℃—30温室中培养。（3）挑取单个菌落接种子斜面养基,如果不纯再移植成纯化，最后得到纯培养。用上述分离土壤中真菌、放线菌和细菌的方法，也可用于分离病虫、病蚕或果蔬上的病原.以划法从病蚕分离黑胸败血病病原菌为例，先％酒精棉球进行表面消毒（注意病虫、病蚕、果蔬等分离的样品不要过份腐烂，便于进行材料的处.取灭菌手术剪剪去病蚕的一只腹足，流出体液作为划分离的材料若分离苹果炭疽病病原菌用无菌镊子揭下有炭疽病苹果的果皮再从此处切取米大小果皮1块，放入盛1mL无菌水试管中，用无菌玻棒捣碎制成悬浮液，划线法分离病原菌。图平板离划线的方法A.连续线法B。分划线法2细菌、真菌放线菌化与鉴定的骤（）粉解验某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶）使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖再被菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色试验时将装有淀粉培养基的三角瓶置于洗水浴中融,后取出冷却至5℃右，即倾入培养中，待凝固后制成平板。每个同学用接种环取少量菌涂在平板上，每个菌种涂片0。3～0小的

圆（见图9-1中种应以草杆菌Bacillussubtilis

）作为对照菌。图－1淀水解试验接种示意图1。枯草孢杆菌2.试验13.大杆菌4.验2将培养皿倒置于7℃恒温箱中培24h,察时打开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻旋,使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明,则明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌解淀粉能力的强弱。二）化的生验许多细菌能从培养基中的含硫有机化合物产生硫化氢。硫化氢遇铅盐（或铁盐）则形成黑色硫铅（或黑色硫化铁验常用氨酸或半胱氨酸作为含硫有机物。1．方法接种与观察：用新鲜斜面培养物（菌种）接种到硫化氢试验培养基中。接种用菌镊子夹取醋酸铅滤纸条用棉塞塞紧使悬挂管中下接进培养基表面不接触液面适温培养于种后314天察，纸条变黑者为阳性，变者为阴性。2.注事项a.此法比较敏感，本培养基不适用于肠杆菌科。b.纸高度应放置适当，离液面太远影响灵敏度，太近容易被溅.同移动试管时也要平稳。c.除白对照,应放阴性对照（)蕊奶验牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪白的分解和利用牛乳中常加入蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂性石蕊呈淡紫色酸时呈红色，碱性时呈蓝,还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况：1。酸固作用细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变,酸度很高,可牛乳凝固，此称为酸凝.

2.凝酸凝固作用某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌具有水解蛋白质的能力，因而产生一些碱性物质，使石蕊变蓝。3。胨作用酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进一石蕊色素被还原脱色。接种大肠杆菌或荧光假单胞菌于石蕊牛乳培养基中，置37℃恒温箱内培养7d。另外保1支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照.四)度微物影微生物生长需要一定的温度条件，不同的微生物，各有其不同的生长温度范围。在生长温度范内有最高、最适、最低三种生长温度。如果超过最低和最高生长温度时，微生物均不能生长，处于休眠状态，甚至死.每组取牛肉膏蛋白胨细菌外面培养基支，贴上标签,注明班级、组号、培养温度等，在无菌操作下枯杆菌斜面菌种进行斜接种2支标记28℃℃℃(冰箱分别放入相应温度下养，48h后观察记录并做实验报告。（）外对生的响紫外线对微生物有明显的致死作用长2左右紫外线具有最高的杀菌效应外对细菌生长的影响是随着紫外线对微生物照射剂量射时间及照射距离的不同微物的生理活动也应地产生不同的效果。剂量高、时间长、距离短时就易杀死它们，剂量低时间短、距离长时就会有量个体残存下来。其中一些个体的遗传特性发生变异。可以利用这种特性来进行灭菌和菌种选育工.细胞中核酸等物质对紫外线的吸收能力特强，吸收的能量能破坏NA的结，抑制了DNA的复制轻则诱使细胞发生变异，重则导致死亡。经紫外线照射后受损害的细胞，如立即暴露在可见光,有一部分仍可恢复正常活力,称为复活现象。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力即使一薄层黑纸，就能将大部分紫外线滤除。本实验即证明紫外线的杀菌作用及穿透能力。方法将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作制成平1付用无菌移液管吸取0.1mL灵菌（或培养h的黄色葡萄球菌）菌液于平板用无菌三角玻棒涂均匀。在皿底部贴上标签，注明组号、班级、处理，再移至无菌室内，打开皿盖，将无菌五角星黑纸置于平板，在距离紫外灯30cm处照射0min，去除黑纸，加上皿盖（20-1于8℃~30℃温箱中倒置培养48h记录结果。

图0－1紫线对微生物生长的影响试验1。挡外线照射的黑纸2。紫线直接照射3.培养细菌生长4。培后细菌不生长（）学剂微物影一些化学药剂对微生物生长有抑制效杀死作用,因此在实验室中及生产上常利用某些化学药剂进行灭菌或消毒。不同化学药剂对不同微生物的杀菌能力并不相.而一种化学药剂对不同微生物的菌效果也不一致因此，使用化学剂进行消毒或灭菌时，应注意药品的浓度及使用时其它因素的干扰和影响。每组的无菌培养皿两付在皿底注明处理方法及菌种名.取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌1支各4mL无菌以菌操作用接种环将菌苔括,制成菌悬液。用无菌吸管各吸取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌0.2mL相的培养皿.将已融化冷却至50℃左右的细培养基（不烫手为宜）分别倒入上述的培养皿中、混匀后凝固成平板。用镊子将备滴有两滴。1％HgCI2、2.5碘酒，75%酒精，％石炭酸的小圆形滤纸片，放于每一平板上，盖上皿盖于8℃～30℃温箱中培48h记录结果。如果有抑制作用，则滤纸片四周出现无菌生长的抑菌圈，圈的大小可表示消毒剂抑菌的强弱（图0—2图20－2园纸片法检测药物杀菌作用1。滤片2。有区。抑菌区（）生对生的响

某些微生物，特别是放线菌，在生命活动过程中产生了一些对其本身无害而能抑制或杀死另外些微生物的特异性的代谢产物，这些特异性的代谢产物称为抗生素。产生抗生素的微生物称为生菌。抗生素在极低浓度下即能抑制或杀死某些微生物在抗菌的筛选中常以其对某些微生物产生的拮抗作用所形成的抑菌圈的大小来衡量抗生菌作用的强弱和抗生素的有效浓度。方法与步骤：将枯草杆菌斜面和黑曲霉斜面各4mL无茵，以无菌操作法制成菌悬液备.取两付无菌培养皿，皿底贴上标签，注明组别及处理，各自用无菌吸管吸取上述菌悬液各分别加入相应培养皿内。取已融化并已保持在50℃左右的菌和真菌培养基各1管倒入相应的培养皿中，轻轻摇匀,制含菌平板用无菌打孔器在长有5406’线菌的培养皿中无菌操作垂直钻取连有培养基的菌块。用灭菌镊子将“5406"菌移至平板上、每个平板放四块。培养皿正放2℃~30℃温箱中2观察菌块周围的透明圈（抑菌圈）大小、并写实验报.三实结1细菌、真菌放线菌落的形态特细菌特:一般呈现较湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀、小而突起或大而平坦、菌落正面或边缘与中央部位的颜色一致、一般有臭味或酸败味等。放菌落征干燥、不透明，小而紧密，呈放射状；菌落初期表面光滑或呈致密的丝绒状，当产生孢子之后其菌落表面呈粉状、颗粒状；菌落和培养基连接紧密，难以挑取，或者整个菌落被挑起而不致破；菌落颜色多样，菌落正反面颜色常不一致，在菌落边缘的琼脂平面有变形的现象；带有泥腥味。霉菌特：由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落扩

展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直—2米或更小。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥,不透明，呈现或紧或松的网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧易取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。2、细菌、真菌和放线菌个的形态征细个体特:个体较小；形状有杆状，螺旋状，球状；没有细胞核，但集区域，有的细菌还有鞭毛，作用是运动；细菌的个体非常小，目前已知最小的细菌只微米长，因此大多只能在显微镜下看到它们。细菌一般是单细胞，细胞结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器，例如粒线体和绿.可根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺杆菌.放菌个体征:放线菌是原核生物的一个类群固体培养基上呈辐射状生长而得名数发达的分枝菌丝菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，0。5~1米。可分为:营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是收营养物质有可产生不同的色素菌种鉴定的重要依据生丝生于营养菌丝上又称二级菌.放线菌细胞的结构与细菌相似,具备细胞壁细膜细质拟等基本结构个种类的放线菌也具有细菌鞭毛样的丝状体但一般不形成荚膜菌毛等特殊结构放菌的孢子在某些方面与细的芽孢有相似之处，都属于内源性孢子，但细菌的芽孢仅是休眠体，不具有繁殖作用，而放线菌产孢子则

是一种繁殖方式。真个体特：真菌都有明显的细胞壁常能运动孢的方式进行繁殖菌通常又分为三类酵母菌霉菌和蕈菌（大型真菌们归属于不同的亚真菌的细胞既不含叶绿体，也没有质体，是典型异养生物。它们从动物、植物的活体、死体和它们的排泄物，以及断枝、落叶和土壤腐殖质中、来收和分解其中的有机物,作为自己的营.真菌的异养方式有寄生和腐生菌为丝状和多细胞的有机体营养体除大型菌,分化很小.高大型菌大都有定型的子实.3细菌、真菌放线菌体生理生化应（1)粉解验果从图中可以看出试验菌周围的无色透明圈最大其次是枯草杆菌最的是大肠杆菌说细产生淀粉酶的能力较,水解淀粉的能力也较强，其次是枯草杆菌，水解能力最弱的是大肠杆菌（2）化的生验由图中可以看出只有接种有枯草杆菌的培养基中的纸条变黑明枯草杆菌为阳性细菌和金黄色葡萄球菌为阴性。（3)蕊奶验

根据实验现象可看出大肠杆的试管没有变色说明没有产生酸性或碱性的物质枯草杆菌发生酸凝固现象，且变红，两支细菌所在的试管已脱色，也出现胨化现象，有分层，下面的为灰色。、环条对生生的响（1）温对生的响培养温度

4C

28C

60C菌名枯草杆菌大肠杆菌

--

+++

+++注：—：不生长+：生长一++生长良好以上结果看出，大肠杆菌的最适温度度左右）比枯草杆菌的最适温度度左温低温对微生物生长均有抑制作用,有最适温度才适合微生物的生长和繁殖。（2）外对生的响1在加黑纸的培养皿中黑纸区内的菌落分布比较均匀且菌种长势较,但是黑纸区域外几乎没有菌落，说明在有六角星黑纸下的细菌没有被紫外线照射抑制和杀死。2。在有光照射的培养皿中，菌在一部分区域较集中，在另一部分区域均匀分布，而且长势较好。说明光下因为有修复作用，多数细菌未被紫外线杀死。3.在无光照射的培养皿中，菌落边缘分布较集中，在中心处数量明显较少，而且部分菌落发黄，说明长势较差，基本上被紫外线杀.明暗处多数细菌因为没有修复作用被紫外线杀死。（3）学剂微物影处理

A0.1

B2％酒

C75％精

D5％石炭酸菌名灵杆菌枯草杆菌

+++++++

+++++

+—

——注：—：没有+：较小+++:大抑制圈最大

从总体上看，灵杆菌的抑制圈均大于枯草杆说明化学药剂对灵杆菌的抑制作用大于枯草杆.（4）生对生的响被抑制菌名称

黑曲霉

枯草芽孢杆菌抑制效果有无细黄链霉菌5406"-注：-:无制菌+：有抑制实验结果表明，抗生素对黑曲霉没有抑制作用，对枯草芽孢杆菌有抑制作用。四实总与验得1、对细菌、真菌、放菌的简单总（1）细菌细菌是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有5×1030个。细菌的个体非常,目前知最小的细菌只有0.2微米长因大多只能在显微镜下看到它们菌生物的主要类群之一于细菌域。细菌一般是单细胞，细胞结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器，例如线粒和叶绿体。基于这些特征，细菌属于