BD多色流式全面解决方案PPT演示课件

BD多色流式全面解决方案LOREMIPSUMDOLOR1Identificationofimmunecellsubsetsbyeight‑colorantibodystaining

NatRevImmunol,20122NatRevImmunol,2012Eight‑colorantibodypanelsproposedbytheHumanImmunophenotypingConsortium3主要内容多色方案中荧光素选择的重要性荧光素同抗原的搭配优化仪器配置，提高分辨率多色Panel设计实例分析4流式多色方案中荧光素选择的重要性LOREMIPSUMDOLOR5V450BV510BV421BV605CD4CD3合适的荧光素选择帮助我们更好的理解实验对于弱的抗原，亮的染料尤为重要荧光素的选择是关键6荧光素的选择是关键CD3BV421V450FITCPerCP-Cy5.5PEPE-CF594AlexaFluor

647AlexaFluor

700CD197(CCR7) 选择正确的荧光素组合是回答生物学问题的关键7荧光素分辨率等级等级由细胞经不同克隆，不同规格的抗体在多种流式细胞仪上的实验所得的染色指数（分辨率）的比较决定激光器的能量，PMT电压，光学部件，抗体克隆和生物样品等多种因素均会影响荧光素/试剂在某个特定仪器上的效果8基于仪器配置选择荧光素9BDHorizonBrilliant™Violet六种被紫激光激发的染料基础多聚体:BV421andBV510串联体:BV605,BV650,BV711andBV786亮的染料减少交叉激光激发减少样品制备影响10与其他染料的比较BV786BV605BV510BV421BV711BV650PEBVCD4试剂与PE比较11BufferCompatibility–SurfaceStainFix/Perm-StainStain-Fix/PermPermIIISolutionHuCD4BV786TranscriptionFactorBufferFix/Perm-StainStain–Fix/PermHuCD4BV51012Buffercompatibility:intracellularstainingUnstimulatedCMVpp65CD4CD8IFN-gPEIFN-gPESEB13紫激光配置检测光学部件需匹配所用的荧光素许多仪器已经配置可以使用纳米晶体染料为最大限度地发挥BDHorizonBrilliantViolet的组合优势，仪器可能需要更新配置更新配置可提高扩展仪器的性能14BDHorizonBrilliantUltraviolet(BUV)两种被355nm紫外激光激发的新荧光素BUV395:对其他检测其几乎无溢漏BUV737:对AlexaFluor700中等溢漏BUV395中等亮度Exmax/Emmax:348nm/395nm滤光片:379/28BPBUV737明亮Exmax/Emmax:348nm/737nm滤光片:740/35BP;690LP15与其他染料的比较BV421PEFITCBUV395BUV737BUVCD4试剂与PE,BV421和FITC比较16BDHorizonBrilliantBlue(BB515)Brightness:VeryBrightExMax490nmEmMax515nmFilter:SameasFITC(e.g.530/30nm)17BB515isuptoseventimesbrighterthanFITCHuCD4 HuCD3MsCD11bHuCD19 HuCD12718BetterresolutionofdimmarkersCD25FITCorCD25BB515andCD3PerCP-Cy5.5,CD4APC,CD127PECD25FITCCD25BB51519荧光素同抗原的搭配理解抗原表达的特性选择最合适荧光素偶联的抗体20三大类:Primary:很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开Examples:CD3,CD4,CD45Secondary:很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTertiary:低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显Example:CD25抗原的分类CD4CD45RACD2521在表达最低密度的抗原上匹配最亮的荧光素抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的这个规则会由于通道间相互溢漏，共表达等原因有所改变抗原密度也会由于激活状态而有所改变抗原密度列表22抗原和荧光素的组合highlowmedium23抗原共表达

Marker的共表达：

Populationresolutionisimpactedbyspillover.细胞群的分辨率会受到通道溢漏的影响Markersco-expressedonspecificcelltypesshouldbeconjugatedtospectrallyseparatedfluorochromes.在特定细胞亚群共表达的marker应该偶联光谱分离的荧光素T细胞panel中-可能用到的marker:CD3,CD4,CD8,CD45RA,CD27,CCR7,CD25,CD12724优化仪器配置，提高分辨率分辨率的重要性优化仪器设置：CS&T荧光溢漏25分辨率分辨率

–流式细胞仪区分弱染色信号和未染色信号的程度在多色情景下更为复杂清晰分群的能力取决于背景和阴性群体的分散度。26分辨率vs.背景阴性群体背景高，不能清晰分群。阴性群体背景低但分散度（相对标准偏差）大，不能清晰分群。“Negative”DimBright阴性群体背景低，分群清晰。27染色指数:分辨率的度量标准亮度阴性信号的宽度阴性群体的宽度取决于仪器性能检测效率,背景荧光和电子噪音[单色]溢漏[多色方案]亮度取决于试剂

抗原密度，所用荧光素仪器通道电压增益，激光器能量28流式细胞仪设置和跟踪(CS&T)系统CS&T是一个由软件（FACSDiva和FACSuite）和试剂（CST微球）整合而成的完整系统。CS&T系统的作用确定决定仪器性能，影响灵敏度/群体分辨率的因素相对荧光检测效率

(Qr)相对光学背景

(Br)系统电子背景噪音

(SDen)标准化仪器设置应用设置跟踪仪器性能29CS&T系统的益处科学家/使用者从多色实验中得到高质量的数据每天提供稳定并可重复的数据根据实验条件优化仪器设置提供每次实验时仪器状态的参数平台负责人/操作者尽早发现仪器性能的下降帮助确定问题的来源提供设置仪器的信息（系统电子背景噪音）30仪器设置

优化PMT电压使弱荧光细胞的分辨率最大化阴性细胞标准偏差法调整PMT电压使得这种方法简单容易，对所有检测器提供更稳定的值用未经染色的细胞CS&T设置对每个参数，设置PMT电压值使弱荧光微球的平均荧光强度等同于10倍的电子噪音这是CS&T设置目标MFI值的PMT电压对大多数参数适用，但对紫激光(V450,BV421)和远红外激光(APC-Cy7,PE-Cy7)通道电压倾向于将电压设置得过高31调整PMT电压以使分辨率(SI)最大化rSDis>2.5SDen(~20)FITC检测器(SDen=20)将电压从373升高至473后，该检测器的分辨率（染色指数）得到显著提高，变为原来的2.6倍将电压从473升至573后，阳性和阴性细胞的荧光强度得到同等程度的增强，对分辨率没有明显改进约473V是理想的PMT电压设置值，其阴性细胞的相对标准偏差

（rSD）大于电子噪音（SDen）的2.5倍32荧光溢漏LOREMIPSUMDOLOR33荧光溢漏的重要性多色方案群体分辨率为了使感兴趣的群体获得最好的分辨率，荧光溢漏是方案设计时唯一最为重要的因素。复杂数据的可视性不正确或欠佳的溢漏值计算会对实验所得的数据质量产生负面的影响。34荧光溢漏到其他检测器导致背景及信号分散，影响分辨率荧光溢漏到其他检测器：比如PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7的检测器荧光溢漏导致：

背景信号(MFI)增强信号分散/分散度（rSD）PE-Cy7PerCP-Cy5.5当样品经过正确地补偿后，被溢漏的检测器所检测到的阳性群体和阴性群体的平均荧光强度是相等的。然而，溢漏所致的信号分散（rSD）及因此引起的分辨率降低并不能被补偿所消除。rSDrSD将溢漏所致的背景扣除的过程称为补偿。29291432928935单色对照计算溢漏值的工具36补偿对照–微球补偿微球的优势易用不需要细胞对于多数荧光素，所得的补偿值与细胞所得的一致37多色Panel设计实例分析38多色实验Panel设计实例分析依据

机器性能

(光路配置)分析中的生物学内在关系

(目的细胞群，抗原密度和共表达)选择的荧光素优先顺序

(荧光亮度和通道间溢漏)应用逻辑规则分配荧光素给特异性抗体396色Treg细胞配色实例40举例1-遵循规则根据抗原表达分配荧光素的原则来优化panel举例2-最好的实践进一步优化panel使Treg的分辨率最大化抗原密度&共表达荧光素的亮度由于通道间溢漏导致的分散程度6色Treg细胞配色实例双激光6色41Fluorochrome抗原密度和荧光素亮度匹配PEAPCPE-Cy7FITCPerCP-Cy5.5APC-Cy7CD25CD127CD45RACD4CD8CD3SpecificityANTIGENASSIGNMENTLaser荧光染料的强度与抗原表达水平相匹配低密度表达抗原需要更亮的荧光素荧光染料之间的重叠最小避免偶联染料带来的假阳性42优化Panel设计来提高Treg的分辨率

通过分配PerCP-Cy5.5给CD8来减少PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7通道的影响CD8APC-H7CD4PerCP-Cy5.5CD127PE-Cy7CD25PECD3FITCCD45RAAPCCD8PerCP-Cy5.5CD4APC-H7CD127AlexaFluor647CD25PECD3FITCCD45RAPE-Cy7通过分散CD25和CD127到不同激光管和选择最小溢漏荧光素来提高Treg分辨率436色T细胞Panel:举例2优化panel后使荧光通道溢漏最小化FITC CD3PE CD25PerCP-Cy5.5 CD8PE-Cy7 CD45RAAlexaFluor647 CD127APC-Cy7 CD4SSCCD3FITCCD25PECD8PerCP-Cy5.5CD4APC-Cy7CD127AlexaFluor647CD45RAPE-Cy7CD25PE446色Panel中例1，例2结果比较1stExample2ndExample例2中CD127和CD25的分辨率都得到提高例2中比较容易对Treg圈门CD127PE-Cy7CD25PECD25PECD25PECD25PECD127AlexaFluor647CD45RAPE-Cy7CD45RAAPC458色T细胞Panel设计LOREMIPSUMDOLOR468色T细胞Panel设计

2个不同方案Expandingthe6-colorpanel

toan8-colorpanel从已有的6色panel开始，在拓展的机器配置上添加marker优化6色方案按照多色panel设计的原则，根据机器配置建立特异性的8色方案Scenario#1Scenario#247方案1:

6色Panel优化到8色PanelCD3CD4CD8CD25CD127CD45RACCR7CD27FITCAPC-Cy7PerCP-Cy5.5PEAPCPE-Cy7BV421BV510紫激光可得BV421andBV510:2个最亮的荧光素亮度和少的溢漏允许被添加进panel然而6色panel并没有考虑添加更多marker，因此对于8色panel来说，并不是最佳的添加了2个新的marker，但整个panel并没有遵循panel设计的原则48方案1SSCCD3FITCCD27BV510CD8PerCP-Cy5.5CD4APC-Cy7CD25PECD45RAPE-Cy7CD27BV510CCR7BV421CD45RAPE-Cy7CCR7BV421CD127AlexaFluor64749FluorochromeV450V500SpecificityASSIGNMENTBV421CCR7PECD27PE-Cy7CD25APC/AlexaFluor647CD127FITCCD45RAPerCP-Cy5.5CD8BV510CD3APC-Cy7CD4Laser方案2:

按照3激光配置优化最佳8色方案50SSCCD3BV510CD27PECD45RAFITCCCR7BV421CD8PerCP-Cy5.5CD4APC-Cy7CD127AlexaFluor647CD25PE-Cy7CD27PECD45RAFITCCCR7BV421方案2:

按照3激光配置优化最佳8色方案518-ColorPanels:

例1和例2中的补偿1st:UsingExisting6-ColorPanelCD25PECD45RAFITCCD127Alexa647CD25PE-Cy7CCR7BV421CD45RAPE-Cy7CCR7BV4212nd:BuildingFromScratchCD45RAFITCCD45RAFITCCD27PECCR7BV421CD27BV510CCR7BV421CD45RAPE-Cy7CD45RAPE-Cy7CD25PEgivesslightlybetterresolutionthanCD25PE-Cy7.CD45RAnegativeshavesigni