人类染色体疾病的诊断三

人类染色体疾病的诊断三第1页，共47页，2023年，2月20日，星期三一、FISH原理（一）、几个概念杂交原位杂交荧光原位杂交依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列，这一过程叫做杂交。原位杂交(insituhybridization)是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。第2页，共47页，2023年，2月20日，星期三原位杂交1）同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)——70年代2）非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)——80年代中后期（1）免疫酶联（2）荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)**同位素原位杂交的不足：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐;5）同位素的使用和处理第3页，共47页，2023年，2月20日，星期三荧光原位杂交（FISH）

FISH技术是常规染色体分析的辅助手段。它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测，并可广泛用于肿瘤的诊断分型，新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常等。第4页，共47页，2023年，2月20日，星期三原理：通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。第5页，共47页，2023年，2月20日，星期三第6页，共47页，2023年，2月20日，星期三二、FISH的优点：1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到结果。3.在同一标本上，可同时几种不同探针，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型。4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。第7页，共47页，2023年，2月20日，星期三三、FISH探针

用生物素或地高辛标记称为间接标记。

杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号。优点：在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大缺点步骤较多,操作麻烦。（一）、直接标记和间接标记第8页，共47页，2023年，2月20日，星期三直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记。优点：由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了烦琐的免疫荧光反应。由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针应用越来越多。第9页，共47页，2023年，2月20日，星期三探针标记在已知探针DNA结构及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin标记的探针应大于100bp，较小的探针可采用PCR技术来标记。近年来，VYSIS公司成功的生产了大片段的DNA探针（100─400kb）。由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。第10页，共47页，2023年，2月20日，星期三（二）、FISH探针的种类1）单拷贝探针：（1）种类：酵母人工染色体（YAC），细菌人工染色体（BAC），Cosmid，Plasmid，cDNA片段（2）应用（a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析。第11页，共47页，2023年，2月20日，星期三２）简单重复序列探针(simplerepetitiveprobes）其靶序列为α卫星DNA或卫星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色体的着丝粒，异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别(b)染色体数目异常检测(c)同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则弥补了G显带的不足第12页，共47页，2023年，2月20日，星期三3）染色体涂染探针（chromosomepaintingprobes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针包括通过流式细胞仪（FACS）分选或显微切割获得的全染色体，染色体臂，或染色体特异性区带涂抹探针应用：检测染色体数目或结构异常。第13页，共47页，2023年，2月20日，星期三四、FISH的临床应用

第14页，共47页，2023年，2月20日，星期三1.在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多，它们是α卫星DNA、β卫星DNA和经典卫星DNA探针。α卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。β卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及染色体的异染色质周围。经典卫星DNA有着AATGG短片段，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围，后两处探针除了可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查。第15页，共47页，2023年，2月20日，星期三染色体着丝粒荧光第16页，共47页，2023年，2月20日，星期三染色体端粒荧光第17页，共47页，2023年，2月20日，星期三FISH检测18三体及Turner综合征结果

左图：18（蓝色）X(绿色)Y（红色）探针，显示18号、X和Y染色体为正常；

中图：18三体综合征病例的FISH结果，有三个蓝色信号（18号）；

右图：Turner综合征病例的FISH结果，1个绿色信号（X单体）

第18页，共47页，2023年，2月20日，星期三FISH检测21三体综合征结果

左图：以13（绿色）21（红色）为探针，显示13号和21号染色体为正常；

中图及右图：21三体综合征病例的FISH结果，有三个红色信号（21号）。第19页，共47页，2023年，2月20日，星期三对于临床来说，对母血清唐氏筛查异常的高危孕妇，可以考虑选择FISH检测。

因为血清学筛查主要针对21、18、13一三体发病风险的统计，80％的常见染色体异常发生在2l、18、l3、X及Y这5对染色体，而FISH针对这些血清学异常已达到很高的特异性及敏感性，且FISH的快速简便，可以极大的缓解孕妇的焦虑情绪。晚孕期的的孕妇也建议使用FISH检测。

因为晚孕期羊水培养失败率较高，而脐血穿刺流产的风险较高，选择FISH检测快速用于临床诊治指导，减轻孕妇的焦虑及负担。

第20页，共47页，2023年，2月20日，星期三FISH检测与传统核型分析相比具有对孕周无严格要求，快速，简便，需要样本量小，可以检测微小缺失等优点，但它也有仅能检出部分染色体数目异常，不能检出染色体结构异常的缺点。

第21页，共47页，2023年，2月20日，星期三2.血液病检测大部分白血病存在某种染色体易位，产生新的融合基因，编码新的融合蛋白。利用这些标志可以诊断不同类型的白血病。特殊染色体异常往往同时有特征性的形态学异常和独特的临床特点，染色体核型与AML患者的预后和治疗密切相关，因此细胞遗传学在WHO分型中占据了重要地位。例如：WHO2001年建议，急性白血病（AML）被划分为以下四组：

(1)急性髓系白血病伴重现性染色体异常；(2)急性髓系白血病伴有多系细胞增生异常；(3)治疗相关的急性髓系白血病与骨髓增生异常综合征；(4)不能归类的急性髓系白血病。第22页，共47页，2023年，2月20日，星期三

检查初始治疗

HLA配型体格检查SouthernBCR-ABL阴性

血小板、血细胞记数Ph1阴性WesternBMTa

生化全套PCR成人CML骨穿±活检FISHBCR-ABL阳性慢性期形态学观察幼稚细胞百分比进行起始治疗（CML-2）嗜碱性细胞百分比

核型分析

Ph1阳性a

NCCN:国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导

2004年第一版

慢性髓性白血病2004年第一版第23页，共47页，2023年，2月20日，星期三细胞遗传学和血液学缓解的标准1血液学完全缓解末梢血完全正常，白细胞<10×109/L

血小板<450×109/L

末梢血中没有不成熟细胞象髓细胞、早幼粒细胞及幼稚细胞。没有疾病的症状及体征和重新出现的可触及的脾肿大。细胞遗传学缓解2

完全缓解：没有Ph阳性的分裂象部分缓解：1%-34%Ph阳性的分裂象轻微缓解：35%-90%Ph阳性的分裂象部分血液学缓解同完全血液学缓解相同除外：存在幼稚细胞血小板较治疗前减少50%，但>450×109/L

持续脾大但范围小于治疗前的50%。1摘自FaderiD等所著：《慢性粒细胞白血病：生物学及治疗》。发表于AnnInternMed131:207-219,1999。2至少检查20个分裂象。第24页，共47页，2023年，2月20日，星期三肿瘤基因变异（或统称突变）的发生是一个累积的和概率的过程。我们每个人体内都在发生着突变，实际上大多数突变是无意义的，因此，一个肿瘤患者基因组内可能有很多变异，可以表现为不同的形式。有的是决定意义的，比如BCR-ABL1融合基因；有的也有一定的辅助意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因组也在持续的发生着动态的变化。一旦出现了新的有意义的突变，还会导致疾病的进展。如部分CML患者发病时只能看到和检测到BCR-ABL1融合基因，但发生急变时就能看到复杂的染色体异常或IKZF1基因的变化。实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了CML进展为急性白血病。第25页，共47页，2023年，2月20日，星期三FISH检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充手段：

传统的染色体检查方法周期长，人工消耗大，而且染色体分析需要有较好质量的中期分裂相。白血病患者肿瘤细胞中期分裂相不易获得，而且有些重要预后意义的累及基因位点的微缺失或仅存在于间期细胞中的异常，传统的细胞遗传学技术是不能检测出来的。

荧光原位杂交技术不需要中期分裂相，因此可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、重复性好、敏感性和特异性高的优点。但需要指定基因特异性的探针，失去了核型分析的宏观性。第26页，共47页，2023年，2月20日，星期三Translocationt(9;22)(q34;q11)第27页，共47页，2023年，2月20日，星期三Translocationt(9;22)(q34;q11)第28页，共47页，2023年，2月20日，星期三在正常的细胞中，两个红点和两个绿点分别表示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正常的细胞中，BCR-ABL融合基因呈现为红绿两种颜色的融合，这种融合基因常常在观察中显示为黄色荧光（箭头所指）。第29页，共47页，2023年，2月20日，星期三五、几种新技术介绍第30页，共47页，2023年，2月20日，星期三1.多色荧光原位杂交（M-FISH）采用全染色体探针（WCP）与染色体杂交，分析染色体数量和结构异常的分子生物学方法。探针是经过聚合酶链反应(Degenerateoligonucleotideprimedpolymerasechainreaction,DOP-PCR)扩增、流式分选、并用5种荧光素组合荧光标记法标记的同源染色体。这种经过标记的探针集合(Pool)与制备好的间期细胞染色体杂交,可使杂交后的每条染色体表现出独有的颜色,从而能够分辨出人的22对常染色体和X、Y两条性染色体(图2[15]),杂交后的图像通过滤光装置被计算机获得并分析得出结果。如果一条染色体的颜色不相同,则提示该条染色体有重组现象,根据每条染色体各自独有的颜色,可以知道哪几条染色体之间进行了重组[第31页，共47页，2023年，2月20日，星期三M-FISH对染色体间复杂易位的分析有突出优势,但是对染色体微小易位(<1MB)的分析则受到限制,而对染色体内部异常的分析则无能为力,这包括染色体的扩增、微小缺失和倒位第32页，共47页，2023年，2月20日，星期三染色体光谱核型比对分析技术（SKY-spectral-karyotyping)-创新的染色体数目和结构异常检查工具原理：光谱核型分析SKY经由CCD相机撷取图像，利用光谱干涉仪及傅立叶转换技术，分辨获得图像每一像素点的光谱，以此标定出不同光谱的不同颜色。优势：对比传统的M-FISH,光谱核型分析技术的采用优势无法比拟。一传统的技术使用显微镜荧光滤镜来分辨荧光信号，缺点存在严重的荧光信号干扰（cross-talk),信号重叠，信号位移等，无法有效分辨染色体，也无法准确诊断染色体的细微变异，异位。而SKY完全克服以上缺点，对图像每一像素的光谱标以不同颜色，显而易见。二从成本上看，不需要电动显微镜，荧光滤镜仅使用一颗SKY滤镜，SKYPaint探针做一次杂交，一次图像撷取，让使用人员减轻时间，精力，同时获取稳定结果。第33页，共47页，2023年，2月20日，星期三第34页，共47页，2023年，2月20日，星期三4.比较基因组杂交

ComparativeGenomicHybridization(CGH)

原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具第35页，共47页，2023年，2月20日，星期三比较基因组杂交（CGH）CGH不需要制备患者的染色体标本,只需采用肿瘤患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或复制。因而CGH最适合于检测实体瘤,淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病.CGH另一无法替代的优点是,它可在一次杂交中检测整个基因遗传物质的增加或减少,但精度有限,对微小的扩增或缺失检测不出,仅适用于对整个基因组进行筛查.CGH也无法发现平衡染色体易位.第36页，共47页，2023年，2月20日，星期三比较基因组杂交原理示意

肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失等比混合第37页，共47页，2023年，2月20日，星期三比较基因组杂交过程第38页，共47页，2023年，2月20日，星期三DAPI4’,6-二联脒-2-吲哚苯FITC异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗丹明人染色体不同荧光素染色结果第39页，共47页，2023年，2月20日，星期三数字化图像第40页，共47页，2023年，2月20日，星期三FITC/TRITC荧光强度比率分析图RatioimageFITC/TRITC第41页，共47页，2023年，2月20日，星