组培设备及其条件

组培设备与条件开展植物组织培育工作需要一个比较合理有用的场所，一套适宜的设备和供应必要的试验环境条件,这是首先要考虑到的。依据科学、合理的原则,一个较为抱负的配置应当包括：1、化学药品室２、配培育基室3、灭菌室4、接种室5、无菌培育室基本仪器设备与用品1、仪器设备超净工作台、高压灭菌锅(手提式、立式或卧式)、小推车(可选)、精密电子天平（至少千分之一)、电子天平或托盘天平、酸度计、一般冰箱、烘箱、解剖镜、光照培育箱(选购)、电炉、微量可调移液器及配套吸嘴、移液管架、磁力搅拌器(可选)、不锈钢托盘、灌装机（可选)、培育架、定时器(把握光照时间）、紫外线杀菌灯、照度计(可选）、温湿度计(可选)蒸馏水器、摇床（可选)、针头滤器及配套滤膜2、小型用品枪镊，弯剪、解剖刀、接种盘３、玻璃器皿组培瓶(玻璃或塑料)、烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、移液管架、容量瓶、试管、酒精、玻璃棒、滴瓶4、组培药品（具体药品请见常用配方)5、其他吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、洗瓶培育条件在植物组织培育中温度、光照、湿度等各种环境条件,培育基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培育育苗的生长和发育。一、温度(ｔeｍpeｒaｔure）由于温度是植物组织培育中的重要因素,所以植物组织培育在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培育都是在23～27℃之间进行,一般接受２5±2℃。低于15℃时培育,植物组织会表现生长停止,高于35℃时对植物生长不利。但是,不同植物培育的适温不同。白鹤非的最适温度是２０℃、月季是２５~２7℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培育育苗的生长速度,也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好,在1２℃以下，３３℃以上形成率皆最低。不同培育目标接受的培育温度也不同,百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25%以下的高。桃胚在2～5℃条件进行肯定时间的低温处理,有利于提高胚培育成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～５ｄ,可得到无病毒苗。二、光照(lｉgｈt)组织培育中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时间方面:1、光照强度(ｌigｈtiｎtensity)光照强度对培育细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的争辩状况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说,光照强度较强，幼苗生长的粗大,而光照强度较弱幼苗简洁徒长。2、光质(lｉgｈtｗａｖｅ)光质对愈伤组织诱导，培育组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培育，８周后,分化出愈伤组织。但在蓝光下培育,几周后才消灭愈伤组织,而唐菖蒲子球块接种15天后,在蓝光下培育首先消灭芽，形成的幼苗生长旺盛,而白光下幼苗纤细。3、光周期（ｌightｐerioｄ)试管苗培育时要选用肯定的光暗周期来进行组织培育,最常用的周期是1６h的光照，８ｈ的黑暗。争辩表明,对短日照敏感的品种的器官组织,在短日照下易分化,而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培育，尤其是一些植物的愈伤组织在暗培育下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。三、湿度（humidity)湿度的影响包括培育容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培育基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当削减琼脂用量，否则,将使培育基干硬,以致不利于外植体接触或插进培育基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度状况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻,也会导致植物生长发育受影响。环境的相对湿度可以影响培育基的水分蒸发,一般要求70%－80%的相对湿度,常用加湿器或经常洒水的方法来调整湿度。湿度过低会使培育基丢失大量水分,导致培育基各种成分浓度的转变和渗透压的上升,进而影响组织培育的正常进行。湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染。四、渗透压(ｐｅnetｒatinｇｐressure)培育基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此,而影响到渗透压的变化。通常１-2个大气压对植物生长有促进作用，２个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而５-6个大气压植物生长就会完全停止,６个大气压植物细胞就不能生存。五、PH值不同的植物对培育基最适PH值的要求也是不同的(见表),大多在５-6．5左右,一般培育基皆要求5．8,这基本能适应大多数植物培育的需要。不同植物的最适ＰH值种类最适ＰH值种类最适ＰH值杜鹃4.０月季５．8越橘4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆５.5桃7.0番茄、葡萄5．7PH值适度因材料而异,也因培育基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说ＰＨ值高于6.5时，培育基全变硬;低于５时，琼脂不能很好地凝固。由于高温灭菌会降低PH值（约0.２-0．3个PＨ值)因此在配制时常提高PH值0.2－０.３单位。PH值大小调整可用０．1Ｍ的NaOH和0.1M的HCｌ来调整。1ml的NaOＨ可使PH值上升0.2单位，1ｍｌ的HCｌ可使ＰＨ值降低0．２单位。调整时肯定要充分搅拌均匀。六、气体(ｇas)氧气是组织培育中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培育基干燥,夏季易引起污染。固体培育基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培育室要经常换气,改善室内的通气状况。液体振荡培育时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培育基等。培育基的成分培育基是植物组织培育中的“血液”,血液的成分及其供应状况直接关系到培育物的生长与分化，因此了解培育基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用,并且能合成植物生长发育所需的几乎全部有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机养分成分,所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥(复合成分)，植物就可良好的生长。但是,在进行植物组织培育时,只是切取植物体的一小部分,它们无法合成生长发育所需要的全部物质，加上人们对植物体的各种组织和器官所需养分成分了解甚少，因此对培育基的组成成分的探究走过了一条格外艰苦而漫长的道路,至今人们还不能完全达到自主的阶段。在所报道的培育基中,没有任何一种培育基能够适合全部类型的植物组织和器官，也没有实现对全部的植物都能通过组织培育使其再生的目的。由于植物的多样性和生长环境的简单性与多变性,也不行能有一种万能的培育基。目前所使用的培育基有１０余种之多,大部分都是在前人争辩的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，Ｗhｉte培育基是Uspｅｎｓkｉ和Uｓpeｎｓkaｉa(1９2５)的藻类培育基演化的结果,被广泛用于根的培育；Cautｈｅｒeｔ培育基是建立在Kｎｏｐ养分液(１８65）基础上的。以后的培育基大部分是在Wｈite和Ｃaｕthｅrｅt培育基的基础上改进而成。就目前所使用的各种培育基而言,可将它们的成分划分为几大类，１、水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不行缺少的物质。配制培育基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培育基成分的精确性，防止贮存过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量争辩上尽量用蒸馏水,以防成分的变化引起不良效果。2、无机养分成分(包括大量元素,微量元素和铁盐）３、有机养分成分（包括维生素,氨基酸及其微生物等)4、碳水化合物５、植物生长调整物质(常称为激素)６、琼脂或其他支持物7、其他添加剂(含自然 提取物、抗生素等）·维生素B1(盐酸硫胺素)·维生素B2(核黄素)·维生素Ｂ6(吡多辛)·维生素C(抗坏血酸)·维生素E（生育酚)·维生素Ａ（维生素甲、视黄醇）·维生素ＡＤ(鱼肝;由丸)·阿发骨化醇·芦丁(维生素P）芦丁(维生素P）维生素Ｂ６,盐酸吡哆醇用途:主要用于防治皮肤粗糙、粉刺、日光晒伤、止痒。也适用于防治脂溢性脱发、皮肤炎症、一般性痤疮,脂溢性湿疹和落屑性皮肤等化妆品制剂。可制成膏霜、乳液和醇溶液。一般与其他维生素协作使用。技术指标:中文名称：维生素B6，盐酸吡哆醇英文名称：VitamｉｎB6,Pyridｏxｉｎ化学名称：6—甲基—5—羟基—3,4—吡啶二甲醇盐酸盐质量指标:熔点:205~209℃鉴别:本品的红外吸取图谱应与对比的图谱全都。酸度:ＰH值应为２.４—３.０产品说明:性状：白色或类白色的结晶或结晶性粉末；无臭,味酸苦;遇光渐变质。在水中易溶,在乙醇中微溶,在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反应。吡哆醇是醇式维生素Ｂ6,是较稳定的一种结构,在酸性或碱性溶液中可耐热維生素B1（鹽酸硫胺素）作用主要用於防治缺乏維生素Ｂ1所致的腳氣病。也用於神經炎、心肌炎、消化不良輔助治療。甲狀腺機能亢進患者,妊娠或高熱患者,可適當補充維生素B1，以改善症狀。罗纳普朗克动物养分公司的盐酸硫胺素（维生素B１）是盐酸铵素粉状产品，符合美国药典标准。组成：化学式C１2H17C１Ｎ4ＯＬＨＣI维生素Ｂ4ＶitaminB４(腺嘌呤,氨基嘌呤,Adｅninｅphｏsphatｅ)【性状】常用其磷酸盐,为白色针状结晶或结晶性粉末。易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚或氯仿。其饱和水溶液呈中性。【药理及应用】本品是核酸的组成成分,在体内参与ＲNＡ和DNＡ合成。当白细胞缺乏时，它能促进白细胞增生，一般用药２~4周左右,白细胞数目可增加。用于各种缘由如放射治疗、苯中毒、抗肿瘤药和抗甲状腺药等引起的白细胞削减症,也用于急性粒细胞削减症。叶酸（维生素ＢC,维生素Ｍ)水溶性；维生素B族中的一种,亦称为维生素BC或维生素Ｍ;计量单位是微克(ｍcg）;是制造红血球不行缺少的物质；挂念蛋白质的代谢。-生物素(d-biotin,1)又名维生素H，属水溶性维生素B族。d－生物素是转化酶的辅酶R,也是蛋白质和脂肪中间代谢中的一个重要辅酶,在维持人和动物正常生长发育，爱护皮肤,羽毛和骨髓健康起着必不行少的作用。因而为医疗,多维制剂和饲料行业等方面得以广泛应用。生物素的补充物为右旋生物素（D－生物素）制剂,纯品一般含D-生物素98％以上，是一种近白色结晶性粉末,在冷水中溶解度低,随水温上升其溶解度增加,但高温时稳定性受到影响,配制生物素溶液时，最适温度为50℃左右。生物素是稳定性较好的一种维生素，对氧化、还原、微量元素都很稳定,强酸、强碱、紫外线对生物素稍有影响,生物素对热敏感。D-生物素(维生素Ｈ)化学名称:Ｄ－Bｉoｔｉｎ（VＩTAＭＩＮＨ)标准:USP2４／BP9８规格:医药级（≥9９．0％）饲料级(≥2%）二四滴(２,4－dichｌoｒoｐｈenoｘyaｃｅｔiｃacid，2,４-D)一种人工合成的具有与生长素类似生理效应的有机物。化学名称为2，4-二氯苯氧乙酸，合成过程简洁,可以大量生产,在农业及园艺生产上已广泛应用。低浓度具有促进插枝生根，阻挡器官脱落,形成无子果实等作用,如1０~1５pｐm(１pｐm=10-6）溶液蘸花或喷洒花簇，即可得到无子果实;高浓度可杀死双子叶植物,作为单子叶植物小麦、玉米、高梁等田间的除草剂。吲哚丁酸(ＩBＡ)和一种植物细胞分裂素:6—苄基腺嘌吟(6—ＢA)Ｄ-生物素/ＶH叶酸／VBc萘乙酸简称NNＡ，是一种植物生长调整剂，近年来在果树生产上应用格外广泛.培育基的种类培育基有很多种类,依据不同的植物和培育部位及不同的培育目的需选用不同的培育基。培育基的产生最早是Sacks(1６80)和Kｎop(16８1），他们对绿色植物的成分进行了分析争辩，依据植物从土中主要是吸取无机盐养分,设计出了由无机盐组成的Sａｃkｓ和Knoｐ溶液,至今仍在作为基本的无机盐培育基得到广泛应用。以后依据不同目的进行改良产生了多种培育基,Whｉｔｅ培育基在４０年月用得较多,现在还常用。而到６0和７0年月则大多接受MS等高浓度培育基，可以保证培育材料对养分的需要,并能生长快、分化快，且由于浓度高,在配制、消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培育基的离子平衡。培育基的名称,始终依据沿用的习惯。多数以创造人的名字来命名,如White培育基,Murasｈige和Ｓｋoｏg培育基（简称MＳ培育基),也有对某些成分进行改良称作改良培育基。目前国际上流行的培育基有几十种,常用的培育基及特点如下：（1)ＭS培育基它是1９６2年由Ｍuraｓhige和Sｋoｏg为培育烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适,可满足植物的养分和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培育基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培育,效果良好。有些培育基是由它演化而来的。(２)B5培育基是1９6８年由Gａmbｏrg等为培育大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵,这可能对不少培育物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B５培育基上生长更适宜,如双子叶植物特殊是木本植物。（3）White培育基是１９43年由Whｉte为培育番茄根尖而设计的。１963年又作了改良，称作Ｗｈite改良培育基,提高了MｇSO4的浓度和增加了鹏素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培育。(4）N６培育基是1９74年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培育而设计的。其特点是成分较简洁,KNＯ3和（ＮＨ4)２SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培育和其他组织培育。（５)KM-８0培育基它是1974年为原生质体培育而设计的。其特点是有机成分较简单，它包括了全部的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培育。培育基的选择1、选择合适的培育基选择合适的培育基是植物组织培育成功的基础。选择合适的培育基主要从以下两个方面考虑:一是基本培育基;二是各种激素的浓度及相对比例。MS培育基适合于大多数双子叶植物，Ｂ5和N6培育基适合与很多单子叶植物,特殊是N6培育基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，Whｉtｅ培育基适合于根的培育。首先试用这些培育基进行初步试验,可以少走弯路,大大;削减时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后,可再依据实际状况对其中的某些成分做小范围调整。在进行调整时,以下状况可供参考。一是当用一种化合物作为氮源时，硝酸盐的作用比铵盐好,但单独使用硝酸盐会使培育基的PH向碱性方向漂移,若同时加入硝酸盐和少量铵盐,会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时,培育的植物会表现出一些症状,可依据症状加以调整，如氮不足时,培育的组织常表现出花色苷的颜色（红、紫红色),愈伤组织内部很难看到导管分子的分化;当氮、钾或磷不足时，细胞会明显过度生长，形成一些格外蓬松,甚至呈透亮     状的愈伤组织;铁、硫缺少时组织会失绿,细胞分裂停滞，愈伤组织消灭褐色年轻症状;缺硼时细胞分裂趋势缓慢,过度伸长；缺少锰或钼时细胞生长受到影响。培育基外源激素的作用也会使培育物消灭上述一些类似的状况,所以应认真分析,不行轻易下结论。2、激素浓度和相对比例的确定组织培育中对培育物影响最大的是外源激素，在基本培育基确定之后，试验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的协作试验。在试验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验,假如有则可直接作为参考；假如没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3-５个水平,再按随机组合的方式建立起如下的试验方案。这样就设计出了１6种激素配比的试验方案，即16种不同的培育基。用着１6种培育基进行初试之后,你会找到１种或几种是比较好的。再在这些比较好的组合的基础上进行小范围的调整,设计出一组新的配方。如在表一中，您认为6号培育基较有期望,就可以在此基础上做出如表二的一组新的设计。表一两种激素４种浓度的组合试验浓度为ｍg?L-1细胞分裂素0.５1．５34.５生长素０12３40.5５67８1.０9１０11１22.01314１５1６有１６种不同的培育基表二其次次激素配比试验浓度为mg?L-１细胞分裂素１.０１．2５1.５０1．７5生长素0．2５１２3４０．5５6７8０．７5９101112有16种不同的培育基一般来说，经过这次试验就可能选出一种适合于你的试验材料的培育基,或许不是最好的,但结果是牢靠的。在此基础上可进行培育基中其他成分的变动试验，如可变动蔗糖浓度、琼脂用量、培育基的PH或添加某些氨基酸等。但必需把握一个原则，就是要有理有据,特殊是对一些贵重的植物培育材料,更要慎之有慎。假如上述试验失败,那就要做一些更细致、更麻烦的试验，花费更多的时间、人力和物力,而且最好在专业人员的指导下进行，切莫依据想象来任凭设计培育基，这样成功的概率微小，使贵重的植物材料丢失,或失去时机。培育基的配制配制培育基有两种方法可以选择,一是购买培育基中全部化学药品,依据需要自己配制;二是购买商品的混合好的培育基基本成分粉剂,如MS、Ｂ5等。自己配制可以节省费用，但铺张时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给试验带来麻烦。就目前国内的状况看,大部分还是自己配制。为了便利起见,现以ＭS培育基为例介绍配置培育基的主要过程。1、配制几种母液(1）配制ＭＳ大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NＨ４NO３16５gKＨ2PＯ417gＫNO3１90gCaCl２·2H２Ｏ4４gMgSO４·７Ｈ２O37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。(2）配制ＭＳ微量元素母液一般将微量元素配制成１00倍母液。依次称取ＫＩ０.08３gNa2ＭoO４·2Ｈ２O0.025ｇH３ＢO３0．６2gCｕSＯ4·5H2O０.00２5gＭnＳＯ４·Ｈ2O1．６9gCoCl２·6Ｈ2Ｏ０.0０2５gＺnSO4·7Ｈ２O0．86ｇ配成1L母液，倒入１L试剂瓶中,存放于冰箱中。CuＳＯ4·5H2O和ＣｏCｌ２·6H2O由于称取量很小,假如天平精确度没有达到万分之一,可先配成调整液。分别称取ＣuSＯ４·5H2Ｏ０.05gCoＣl2·６H２Ｏ０.05g各自配成100ml的调整液,然后取5ｍｌ就还有0.00２５g的量。(3)配制MＳ有机母液一般配制成100倍ＭS有机母液。依次称取肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）０.0１g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇（VB６）0.05ｇ配成1Ｌ母液，倒入１Ｌ试剂瓶中,存放于冰箱中。（4)配制MＳ铁盐母液一般配制成10０倍MS铁盐母液。依次称取EDＴA二钠3．73gFeSＯ４·7H２Ｏ２.7８ｇ配成1L母液，倒入1Ｌ试剂瓶中,存放于冰箱中。所以MS母液有５种大量元素母液,加上MＳ微量元素母液、MＳ有机母液和MＳ铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量９5%的酒精或1当量的NａＯH溶解，细胞分裂素一般要先用１当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水定容。一般取1０0mg配成10０ml母液。2、配制培育基以配置1ＬMS培育基为例，按挨次进行如下操作：（1)先在烧杯中放入一些蒸馏水。(2）分别取上面八种母液１0ｍl倒入。(3）一般称取3０g蔗糖倒入,搅拌溶解。（４)加蒸馏水用量筒定溶至1L。(5)按设计好的方案添加各种激素,由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,削减误差。（6)用精密试纸或酸度计调整PH至5.７-5.８。（有条件的话使用酸度计,比较精确)可配１当量的HCL和１当量的ＮaOＨ用来调溶液ＰH值。1当量HＣL配制:用量筒量取８.3ml配成１０0ml溶液。１当量NaOH配制:称取NaOＨ4g配成1０0ml溶液。(7)称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。(8)略微冷却后，分装入培育容器中。无盖的培育容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮筋或绳子扎紧。(９)放入消毒灭菌锅灭菌,灭菌２0分钟左右。(10）灭菌后从灭菌锅中取出培育基,平放在试验台上令其冷却凝固。有机养分成分有机养分成分包括维生素、氨基酸或某些有机混合物。维生素在某些酶系统中有催化作用，加速酶功能的发挥。硫氨素(维生素B1）可能是几乎全部植物都需要的一种维生素，缺少维生素Ｂ１时离体培育的根就不能生长或生长格外缓慢。维生素Ｂ１经常以盐酸盐的形式即盐酸硫胺素加入培育基中。盐酸吡哆醇(维生素B6）和烟酸可能有刺激生长的作用。在细胞分裂素浓度低于0．1mg/L的状况下特殊需要添加维生素B1，在细胞分裂素浓度高于0.1ｍg／Ｌ时,烟草细胞在没有维生素B1的培育基上亦可缓慢生长，这表明细胞分裂素可能有诱导植物合成维生素B1的作用。除维生素B１、维生素B6之外，在部分培育基中还添加维生素BX(氨酰苯甲酸)、维生素C（抗坏血酸)、维生素E（生育酚）、维生素H(生物素)、维生素Ｂ12（氰钴胺酸)、维生素ＢC(叶酸)、维生素B2(核黄素)、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。除叶酸外各种维生素都溶于水,叶酸需要先用少量稀氨水溶解,再加蒸馏水定容。甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇(环己六醇）也是一些培育基的添加成分。另外,在某些植物或某些组织的培育中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用,如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。无机养分成分无机养分成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它们在植物生活中具有格外重要的作用,如氮(N)、硫（S)、磷(P）是蛋白质、氨基酸、核酸和很多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不行缺少的关系。氮占蛋白质含量的16%-18%，在植物生命活动中占有首要的地位,故又称为生命元素。磷是能量货币腺苷三磷酸（ＡTP）的主要成分之一，与全部生命活动紧密相连，在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不行缺少。钾对于参与活体内各种重要反应的酶起着活化剂的作用，钾供应充分时糖类合成加强,纤维素和木质素含量提高,茎秆坚韧,植株健壮。胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几乎是全部蛋白质的构成分子。镁离子（Ｍｇ２+)是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁,叶绿素就不能形成，叶子就会失绿，就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分，在细胞分裂过程中起作用。钙是细胞壁的组分之一，果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分,缺钙时细胞分裂受到影响,细胞壁形成受阻,严峻时幼芽、幼根会溃烂坏死。现代生物学争辩还证明钙是植物体内的信号分子(信使）之一，在植物信号转导中发挥重要作用，钙离子与钙调蛋白结合形成的Ca２+·ＣaＭ复合体，能活化各种酶,调整植物对外界环境的反应与应答过程。依据植物对这些元素要量的不同或者依据目前植物培育基中添加的这些元素量的大小,可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培育基中的浓度大于０．５mmol/L的元素，微量元素指小于0.5mmol/L的元素。1、大量元素主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。其中，氮常以硝态氮(NO3-)或氨态氮(NＨ４＋)，或两者相互协作的形式存在。缺氮时某些植物的愈伤组织会消灭一种很引人注目的花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。镁常ＭgＳＯ4·7Ｈ２O的形式，既供应了镁也供应了硫。硫还有用Na2ＳＯ4的形式供应，不过其中的钠（Nａ)对植物并不是必需的,或者说经常是不利的。磷常以NaH2PO４·H2O，KH２PO４或(NＨ4)H２PO4的形式供应。钾常以KＣl、ＫNO3或ＫH2PＯ４形式。钙常以CaCl2·2H2Ｏ、Ca（ＮＯ3）２·4Ｈ２O或其无水形式供应。缺硫时培育的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。（１）N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不行缺少的物质。在制备培育基时以硝态氮(NO3-）或氨态氮(NH4＋)两种形式供应。大多数培育基既含有硝态氮（NO3－)又含有氨态氮（NH4＋)。氨态氮(NH4+)对植物生长较为有利。供应的物质有KNO３、NH4ＮO3等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。（2)Ｐ是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ＡDP等的组成成分。在植物组织培育过程中,向培育基内添加磷,不仅增加养分、供应能量，而且也促进对N的吸取,增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有ＫH２ＰＯ4或NaH2PO4等。（3)K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有亲密关系。Ｋ增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大,一般为1－3mg/L为好。制备培育基时，常以ＫCl、ＫＮO3等盐类供应。(4)Ｍg、S和Cａ、Mg是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂；S是含Ｓ氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgＳO4.7H2Ｏ供应。用量为１-3mg／L较为适宜;Ｃa是构成细胞壁的一种成分，Ｃa对细胞分裂、爱护质膜不受破坏有显著作用，常以CａCl2.２H29供应。2、微量元素培育基的微量元素主要包括铁（Fe)、锰（Mn)、铜(Cu)、锌（Zｎ)、氯(Cl)、硼(B）和钼（Ｍo）等。这些元素有的对生命活动的某个过程格外有用，有的对蛋白质或酶的生物活性格外重要,有的是参与某些生物过程的调整。Fｅ有两个重要功能，作为酶的重要组成成分和合成叶绿素所必需,缺铁时细胞分裂停止。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用,是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B能促进糖的过膜运输,影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用,改善某些植物组织的培育状况，缺硼时细胞分裂停滞,愈伤表现出老化现象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的,也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Ｍo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。Cl在光合作用的水光解过程中起活化剂的作用,促进氧的释放和还原NＡDＰ(辅酶II)。为了某些植物组织培育的特殊需要有人还把钠（Na）、镍（Nｉ）、钴（Co)、碘(I）等也加入微量元素的行列。Ｎa对某些盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物是必需的。Ni对尿酸酶（ureａsｅ）的结构和功能是必需的。但是有些成分的作用至今还不格外清楚,可人们仍旧把它们加入培育基中,如碘(Ｉ)和钴(Ｃｏ)等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培育基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。铁作为一种微量元素,对植物也是必需的,但由于Fe的特殊性质,即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定,故在培育基配制时经常把Fe盐单独配制，且常以螯合物的形式，把ＦｅSＯ４和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠（Na２EDTA)先分别配成溶液,再相互混合使形成螯合铁，以防沉淀和挂念被植物吸取。但EＤTA可能对某些酶系统和培育物的形成发生有肯定的作用,使用时应慎重。为了使用便利，无论是大量元素还是微量元素都经常是先配制成母液（即比实际培育基中的使用浓度高的储存液)，储存在４度冰箱内或在室温下短期存放。总之，植物必需养分元素可组成结构物质,也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂,参与活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些养分元素供应不足时,愈伤组织表现出肯定的缺素症状。如缺氮,会表现出一种花色素苷的颜色,不能形成导管;缺铁,细胞停止分裂;缺硫,表现出格外明显的褪绿;却锰或钼，则影响细胞的伸长。碳水化合物全部的植物组织培育基都需要有碳水化合物作为能源,但当培育物通过光合作用供应的CO２能足以维持生长时可不在培育基上加碳源,这种状况是很少见的。用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖,用量通常为２%－4％，高者可达5%,亦可用市售的白糖所代替,但一般应增加用量,而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证明验的稳定性。在改用一批新的市售白糖时最好先做预试，以防在大量使用时消灭问题，损害培育材料,造成不必要的损失，由于市售白糖是一种混合物,成分简单且不稳定。几乎全部的培育物在蔗糖作为碳源时生长都比较好,只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培育基上生长更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源的。蔗糖在经高温灭菌后,会发生部分降解，产生D-葡萄糖和Ｄ-果糖等,与用过滤法灭菌相比，可能会消灭一些不同的试验结果,但这并不说明高温灭菌与过滤灭菌哪一种方式更好。假如要进行比较严格、精确的试验，最好用过滤法灭菌蔗糖，除此之外在大部分状况下可与培育基一起进行高温灭菌。争辩表明蔗糖不仅作为碳源影响到培育物的养分状况,而且在某些状况下还会影响到细胞的分化,如在进行叶用莴苣的髓细胞培育时,诱导木质部分化的适宜浓度为２g/Ｌ,但要让木质部进一步发育则最好再提高蔗糖浓度,这样才能更有利于木质部的形成。木质部成分的分化,特殊是管胞分子的分化形成，往往是器官发生的先决条件。蔗糖、葡萄糖、白糖等的纯度问题，现在也引起人们的留意,由于在结晶时，它们往往包藏有恒量的有机物如氨基酸等,这些虽然不会使试验受到很大影响,但有时可能影响到试验结果的分析,在使用时应稍加留神。糖的种类和用量是植物组织培育能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和广泛性,这一点已无人怀疑。近年来,其它糖类在植物组织培育中的作用引起很大关注。在淀粉作为凝固剂的培育基中加入1２%蜜二糖，比只加8％蔗糖的大麦花粉培育基产生胚状体的频率高3５倍,可高达4０%。乳糖、麦芽糖、半乳糖和甘油均可显著促进培育的柑橘的胚状体发生。麦芽糖、麦芽浸出物和果糖对苜蓿胚状体发生的促进作用均大于蔗糖。葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖对培育的烟草原生质体再生都有促进作用,半乳糖则有抑制作用。麦芽糖可明显提高培育的大麦花药的绿苗产率,而蔗糖、果糖和葡萄糖单独或麦芽糖混合使用，均不利胚状体的生长。植物生长调整剂植物生长调整物质是一些调整植物生长发育的物质。植物生长物质可分为两类：一类是植物激素;另一类是植物生长调整剂。植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量（1微摩尔/升以下）有机物；植物生长调整剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。但在平常工作中人们并没有将它们严格区分开来,而笼统称之为“激素”、“植物激素”或“植物生长调整物质”。这类物质既可以刺激植物生长,也可以抑制植物的生长,对植物的生命活动真正起到调整作用。在植物组织培育中使用的生长调整物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类,少数培育基中还添加赤霉素GA3等。１、生长素生长素在植物体中的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子。成熟叶片和根尖也产生很微量的生长素。在植物组织培育中,生长素主要被用做诱导刺激细胞分裂和根的分化。在植物组织培育中常用的生长素有：NAＡ(萘乙酸)、IＡA(吲哚乙酸)、IBＡ(吲哚丁酸)、NOA(萘氧乙酸），P-CPＡ(对氯苯氧乙酸)、2,４-Ｄ(２,4-二氯苯氧乙酸),２，4，５－T(２,4,5－三氯苯氧乙酸）等。NＡA有α-和β-两种形式,是由人工合成的,培育基中总是用α－型,所以在配制培育基时总是说加α-萘乙酸。与IBA相比,NAA诱发根的力量较弱,诱发的根少而粗,但对某些植物如杨树等却具有很好的效果,ＩBＡ在根的诱导与生长上作用猛烈,作用时间长，诱发的根多而长,特殊有效,但也不行一概而论。IBA是自然 合成的生长素,可被光快速溶解或被酶所氧化,由于培育基中可能有氧化酶存在，所以在使用浓度上应相对较高(１-30mｇ/L)。对愈伤组织增殖最有效的是2,４－Ｄ,特殊是对单子叶植物,１０-7-10－5ｍoｌ/Ｌ即可以诱导产生愈伤,经常不需再加细胞分裂素。但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂,不能用于启动根和芽分化的培育基中。２、细胞分裂素细胞分裂素是腺嘌呤(adｎiｎe,也叫６－氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第６为氨基、第2位碳原子和第９位氮原子上的氢原子可以被不同的基团所取代,当被取代时就会形成各种不同的细胞分裂素,因此,精确     的讲应当叫细胞分裂素类物质。植物和微生物中都含有细胞分裂素。细胞分裂素在植物生长发育的各个时期均可表现出它的调整作用，由于它是一种腺嘌呤的衍生物,所以人们联想到它的调整作用,由于它的调整作用可能对核酸的影响有关。它可以影响某些酶的活性，可以影响植物体内的物质运输，可以调控细胞器的发生，还可以打破某些植物种子的休眠和延缓叶片的年轻。现代生物学争辩初步证明,细胞分裂素可以结合到高等植物的核糖核蛋白体上,促进核糖体与ｍRNＡ的结合，加快翻译速度，从而促进蛋白质的生物合成。它还可以与细胞膜和细胞核结合，影响细胞的分裂、生长与分化。在ｔRNA分子的反密码子四周发觉有细胞分裂素的结合位点,这可能预示着细胞分裂素在基因表达的翻译水平上具有调整作用，其实,细胞分裂素本身就是ｒRNA的组成部分,植物tRＮA中的细胞分裂素就有异戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基异戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等数种。自然状况下,细胞分裂素主要在根中合成,但根并不是唯一的合成部位，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成。在组织培育中使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高,抑制根的生长。培育基中经常使用的自然 的细胞分裂素主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分别到的玉米素［6-（4－羟基-３-甲基-反式-2－丁烯氨基)嘌呤]。人工合成的细胞分裂素主要有感动素（KＴ，6－呋喃氨基嘌呤)、６-苄基腺嘌呤（６-BA）、２IＰ(异戊烯氨基嘌呤）和TＤＺ(thｉdiazuｒｏn,噻二唑苯基脲)等。细胞分裂素经常与生长素相互协作,用以调整细胞分裂，细胞伸长,细胞分化和器官形成。3、赤霉素主要是ＧＡ3,虽然已经用于顶端分生组织的培育和维管分化的争辩,但在培育基中很少添加,由于它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道,但在使用中仍需慎重,不行轻易添加。假如想在试验中添加赤霉素,则必需先用一些不重要的材料做预试,待获得确定结果时再用于正式试验。４、乙烯乙烯的作用渐渐引起重视,它在芽的诱导和管胞分化上具有肯定作用,管胞分化往往又是器官发生的基础。乙烯单独地或与CＯ2共同加入瓶中以代替BA或ＢＡ+2，4-D的作用,促进水稻愈伤组织芽的生长,CＯ2对乙烯促芽的促进作用明显,AｇNＯ３可逆转乙烯和2,4-Ｄ的抑制作用,促进小麦愈伤组织生芽。在有IAＡ和KT时乙烯促进Wigitalｉｓｏbscｕra芽的形成。乙烯对芽形成的这种相对独立的效果不只是由于种的差异，也与不同发育时期植物对乙烯的敏感性不同有关。如烟草的组织随着培育时间而对乙烯的敏感性有变化,在培育早期促进芽的发端，后期则起抑制作用。温度可以影响乙烯的产生量,２５-３５℃下产生量较高,可促进水稻培育细胞产生根，15℃或4０℃下产生量降低，不生根。番茄叶圆片培育时,乙烯抑制IAＡ诱导的生根。一般说来，依稀抑制体细胞胚胎发生,非胚性愈伤组织比胚性愈伤组织产生更多的乙烯。在悬浮培育中,乙烯对细胞的指数生长期有双向作用。由于乙烯是一种简洁的不饱和碳氢化合物,在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻,试验中很难把握用量,所以一般不使用。高等植物各器官都能产生乙烯，但不同组织、不同器官和不同发育时期,乙烯的释放量不同。在组织培育中,培育的植物组织也会产生乙烯,假如封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会渐渐积累乙烯,严峻时可引起培育物的死亡。培育瓶内乙烯的积累量因植物种类而不同,小麦的悬浮细胞培育物2４Ｈ中每克干重可产生乙烯5nmol,水稻的为６nmol,亚麻的可高达900ｎmｏl。烟草的愈伤组织产生的乙烯量比胡萝卜的高4００倍。琼脂或其他支持物除液体悬浮培育外,全部的培育物都应生长在固定或半固定的培育基上以防止培育物沉入液体培育基,因缺氧而死亡。就目前状况而言,琼脂是一种极为抱负的支持物。它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培育基中的必需成分,只是作为一种凝固胶黏剂使培育基变成固体或半固体状态,以支撑培育物，虽然琼脂只是作为一种胶连物，但由于其生产方式和厂家不同而可能含有数量和种类不等的杂质,如Ca、Mｇ、Ｆe、硫酸盐等，从而可能影响到培育效果或某些试验的结果。在选择琼脂时,最好固定厂家,但国内尚没有一个比较稳固的生产厂家供应优质琼脂。虽然市售的琼脂或琼脂条价格廉价,可以使用,但其带来的潜在副作用可能是组培失败或中途夭折的主要缘由。建议在经济条件允许的状况下，建议买进口、固定厂家的商品。琼脂的使用浓度取决于培育目的,使用的琼脂性能（胨力张度、灰分、热水中不溶物、粗蛋白等)等因素，一般浓度为0.4%－1%，质量越差的琼脂用量越大。除琼脂外，为了更好的调控培育物的生长，现在进展的趋势是使用一种含有琼脂的混合物作为固体胶连剂，如Ｓigma公司生产的Agargeｌ就是用琼脂和Pｈytagｌ混合在一起的一种新型胶连剂,可以用来把握培育物的玻璃化。培育基中添加琼脂使培育基呈固体或半固体状态,使培育物能够处于表面,既能吸取必需的养分、水分,又可不致因缺氧而死亡。但固体或半固体状态，一方面限制了培育基中养分成分和水的移动;另一方面也限制了培育的植物组织分泌物,特殊是有毒代谢产物的集中，使有培育物四周的养分成分渐渐匮乏,代谢产物渐渐积累，植物生长受阻或受到毒害。为了解决这个问题,人们试验使用其他支持物来代替琼脂。滤纸桥法即是一种,该法是将一张较厚的滤纸折叠成M型，放入液体培育基中,将培育的植物组织放在Ｍ的中间凹陷处，这样培育物可通过滤纸的虹吸作用不断吸取养分和水分，又可保持有足够的氧气。在此基础上，又进展出了一种类似与“看护”培育的方法,即在滤纸桥的中间凹陷处加一种固体培育基,固体培育基中也可混有分散的植物细胞团,将材料放在固体培育基上,再把滤纸放入另一种液体培育基中，用两种不同的培育基同时培育材料，可收到较好的效果。现在也有用玻璃纤维滤器或人工合成的聚酯羊毛代替琼脂的试验中人们或许能受到一些启发,即培育基中添加琼脂的目的主要是为了支持培育物,只要达到这个目的，可选用不同的材料和方法进行代替琼脂的试验。需要考虑的主要问题是，这种材料必需无毒害作用，且不被培育的植物组织所吸取,不与培育液成分发生化学反应。琼脂作为支持物或凝固剂对绝大部分植物都是有利的或者说是无害的，但也有一些报道说琼脂对某些培育物不利。在马铃薯、胡萝卜、烟草、小麦等作物组培中,均发觉以淀粉代替琼脂更有利于培育物的生长和分化。但是,目前状况下还没有哪种支持物比琼脂更优越。其他添加剂为了特殊的培育目的，在一部分培育基中还添加了一些特殊成分,如水解酪蛋白,水解乳蛋白,甲硫氨酸(蛋氨酸）,L-酪氨酸、L－天冬氨酸、Ｌ-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、Ｌ-精氨酸等氨基酸,酵母提取物,胰蛋白胨,椰乳，西红柿汁，香蕉粉,橘子汁，可可汁，活性炭，渗透调整剂等。添加少量甲硫氨酸有促进乙烯合成和刺激木质部发生的作用，但添加多种氨基酸后往往有制止生长的作用，这可能是由于各种氨基酸之间的相互竞争而引起的。对自然 提取物的应用虽然有不同观点,有的主见使用,有的主见不使用，由于其养分成分和作用无法弄明白,但在用已知化学物质无法达到目的时，适当使用一些自然 混合物，的确使一些用常规培育方法没有获得愈伤或不能诱导再生的植物产生了愈伤和分化形成植株。1、活性炭活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构,它结构疏松、孔隙大，吸水力强,有很强的吸附作用,它的颗粒大小打算着吸附力量。粒度越小,吸附力量越大。温度低吸附力量强，温度高吸附力量弱,甚至解吸附。通常使用浓度为０．5-10ｇ／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培育物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的５-羟甲基糖醛及激素等。茎尖初代培育，假如适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于ＶＣ和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长,但其作用有一个阀值，一般为0．1%-0.２5,不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAＡ,但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照爱护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸取力量增加,反过来又促进了茎、叶的生长。此外,在培育基中加入０．3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。活性炭在胚胎培育中也有肯定作用,如在葡萄胚珠培育时向培育基加入0．1％的活性炭，可削减组织变褐和培育基变色,产生较少的愈伤组织。但是,活性炭具有副作用,争辩表示,每毫克的活性炭能吸附100nｇ左右的生长调整物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培育基中调整物质。大量的活性炭加入会减弱琼脂的凝固力量，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培育瓶。总之,那种任凭抓一撮活性炭放入培育基,会带来不良的后果。因此,在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其乐观作用。或许是由于活性炭的存在使培育基变黑,产生了类似于土壤的效果,以利于植物的生长。还有报道指出,活性炭有刺激胚胎发生或组织生长和形态发生的作用。活性炭来源的不同也可能使它所起的作用不同,如木材活性炭比骨质活性炭含有更多的碳，而骨质活性炭中含有的混合物可能对培育物有副作用。2、渗透调整剂植物细胞对水的吸取受到其所含液泡与培育基之间的相对水势所把握。培育基中影响水分利用的主要成分是琼脂的百分含量，蔗糖的含量和添加的一些用于调整渗透压的非代谢物。渗透调整剂往往是选用一些代谢微弱的糖来充当,如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，这些糖基本上不被培育的植物组织所吸取，而只存留在培育基中,起到调整渗透的作用。３、抗生素培育的植物组织,很简洁发生细菌或真菌污染。引起的缘由是多方面的，有的是消毒不彻底,有的是无菌操作过程中器皿或操作人员不留意,有的是消毒不彻底,有的是无菌操作过程中器皿或操作人员不留意,有的是培育过程中由于盖培育容器的盖子破损或没扎紧，有的是培育的植物组织内部携带有病原物,表面消毒不解决问题。污染会给组培工作带来很大影响或损失,尤其是已经培育一段时间的材料在发生;污染所造成的损失更大。为了解决或防止这个问题，可在配置培育基时添加抗生素,比如加２００－３0０U的庆大霉素可使细菌污染受到很好的把握,浓度超过600U时可在肯定程度上抑制分化,但这种抑制作用可在除去庆大霉素后异端时间内得到恢复。4、抗氧化剂植物组织在初割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒,使培育的材料生长停顿，失去分化力量可，最终变褐色死亡。在木本,尤其是热带木本及少数草本植物中较为严峻。目前还没有彻底完善的方法,只能按不同的实际状况，加用一些药物,并适当降低培育温度、准时转移到新颖培育基上等方法,使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位,加大接种数量等也应一并考虑。抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及VC，可用5０-200mｇ／L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后假入固体培育基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯。5、椰乳是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种自然 复合物。一般使用浓度在10%－20％,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培育中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织很草莓微茎尖培育中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过1ｍm时，椰乳就不发生作用。6、香蕉用量为15０-2０0mｌ／L。用黄熟的小香蕉，加入培育基后变为紫色。对ＰH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培育中应用，对发育有促进作用。7、马铃薯去掉皮和芽后,加水煮30分钟,再经过过滤,取其滤液使用。用量为150-２00g/L。对PＨ值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。8、水解酪蛋白为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸,使用浓度为１00-2００mｇ/L。受酸和酶的作用易分解,使用时要留意。9、其他酵母提取物(YＥ)（０.01％-０．0５％）,主要成分为氨基酸和维生素类;麦芽提取物（0.０1％-0．５％)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定,大多在培育困难时使用,有时有效。培育基的配制配制培育基有两种方法可以选择,一是购买培育基中全部化学药品,依据需要自己配制；二是购买商品的混合好的培育基基本成分粉剂，如MＳ、B5等。自己配制可以节省费用，但铺张时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给试验带来麻烦。就目前国内的状况看，大部分还是自己配制。为了便利起见,现以ＭＳ培育基为例介绍配置培育基的主要过程。1、配制几种母液(1)配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成10０倍的母液,使用时再分别稀释1０0倍。分别称取NH4ＮO３1６5gＫH2PO417gKＮO３1９0ｇＣaＣl2·2H2Ｏ44gMgSO4·７Ｈ2O37ｇ各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。(２)配制ＭＳ微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI０.０83ｇNa2MｏＯ4·２Ｈ２Ｏ0．０２5ｇH3BO３0.6２gＣuSO4·5Ｈ2Ｏ0．00２５gMnSＯ4·H2O1.６9gＣoＣｌ２·６H2O０.002５gZｎSO４·７H２O0.８6ｇ配成１L母液,倒入1Ｌ试剂瓶中,存放于冰箱中。ＣｕＳO4·5Ｈ2O和ＣoＣl2·6Ｈ２O由于称取量很小，假如天平精确度没有达到万分之一,可先配成调整液。分别称取ＣuＳO４·5H2O0.05ｇCoCｌ2·６Ｈ２O０.05ｇ各自配成10０ml的调整液，然后取5ml就还有0.002５g的量。(3)配制MS有机母液一般配制成１00倍MS有机母液。依次称取肌醇1０ｇ盐酸硫胺素(VB１)0．01g烟酸0．05g甘氨酸０.２g盐酸吡哆醇(VＢ6）0.05g配成1L母液,倒入1Ｌ试剂瓶中,存放于冰箱中。（4)配制ＭS铁盐母液一般配制成1０0倍MＳ铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73gFｅSO４·7H2O２.78g配成1Ｌ母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。所以ＭS母液有５种大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有机母液和MＳ铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起，生长素类一般要先用少量９5%的酒精或1当量的ＮaOH溶解,细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水定容。一般取1０0mg配成1０0mｌ母液。2、配制培育基以配置１LMＳ培育基为例，按挨次进行如下操作：（1)先在烧杯中放入一些蒸馏水。(2）分别取上面八种母液１0mｌ倒入。(3)一般称取3０ｇ蔗糖倒入，搅拌溶解。(4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。(5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小,而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,削减误差。(6)用精密试纸或酸度计调整PＨ至5.7－５．8。(有条件的话使用酸度计,比较精确）可配1当量的HCL和１当量的ＮaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制:用量筒量取8．３ml配成10０ml溶液。1当量NaOH配制:称取NaOH４ｇ配成1００ml溶液。（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。(８）略微冷却后,分装入培育容器中。无盖的培育容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅灭菌,灭菌２0分钟左右。(１０）灭菌后从灭菌锅中取出培育基，平放在试验台上令其冷却凝固。灭菌灭菌是组织培育重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简洁煮沸的培育基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培育容器无论洗得多洁净等等都是有菌的。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是:微小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简洁，繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。无菌的范畴是:经高温灼烧或肯定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必需已经证明是有效的),高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把全部生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消退或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,明显经过消毒,很多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。植物组织培育对无菌条件的要求是格外严格的,甚至超过微生物的培育要求，这是由于培育基含有丰富的养分,稍不当心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的,必需依据不同的对象实行不同的切实有效的方法灭菌,才能保证培育时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要依据工作中的不同材料不同目的适当选用。1、培育基用湿热灭菌培育基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在０.1ＭPａ的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。留意完全排解锅内空气，使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后，待压力上升到０.０５MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到0．1ＭPａ时,开头计时，维持压力0.１-0．15ＭPa，20分钟。按容器大小不同,保压时间有所不同,见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字,假如容器体积较大,但是放置的数量很少，也可以削减时间。培育基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器的体积／mL在121℃灭菌所需最少时间/min20-50157５-１5020250-５0０25100030到达保压时间后,即可切断电源,在压力到0．5ＭＰa，可缓慢放出蒸汽，应留意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培育基,摆在平台上，以待冷凝。不行久不放气,引起培育基成分变化，以至培育基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开，大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了。对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种工具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培育基要严格遵守保压时间,既要保压彻底，又要防止培育基中的成分变质或效力降低,不能任凭延长时间。对于一些布制品，照试验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭局20-３0分钟。高压灭菌前后的培育基,其PＨ值下降０.2-.3单位。高压后培育基PH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高PＨ值至预定值的则相反。培育基中成分单一时和培育基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的ＰＨ值变化幅度较大，甚至可大于2个ＰH值单位。环境PＨ值的变化大于0.５单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培育基中的蔗糖水解为单糖,从而转变培育基的渗透压。在8％-20％蔗糖范围内,高压灭菌后的培育基约上升0．43倍。培育基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使1５％-25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培育基值小于5.５，其水解量更多，培育基中添加0.１%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增加，添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5％。为防止高压灭菌产生的上诉一些变化可用下列方法:(１）经常留意搜集有关高压灭菌影响培育基成分的资料,以便准时实行有效措施。(２）设计培育基配方时尽量接受效果类似的稳定试剂并精确     把握剂量。如避开使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBＡ代替IAA，把握活性炭的用量(在0.1％以下)留意PH值对高压灭菌下培育基中成分的影响等。(3)配制培育基时应留意成分的适当分组与加入的挨次。如将磷、钙和铁放在最终加入。（4）留意高压灭菌后培育基PＨ值的变化及回复动态。如高压灭菌后的PH值常由5．８上升至6.48。而96小时后又回降至５.8左右。这样在试验中就可以依据这一规律加以把握。2、用于无菌操作的器械接受灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,马上使用。操作中可接受250或500毫升的广口瓶,放入95%的酒精，以便插入工具。3、玻璃器皿及耐热用具接受干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到１6０-１80℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的养分细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常接受１70℃持续9０分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免防碍热对流和穿透,到指定时间断电后，待充分冷凉,才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿裂开。干热灭菌能源消耗太大，铺张时间。４、不耐热的物质接受过滤灭菌一些生长调整剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的,不能用高压灭菌处理，通常接受过滤灭菌方法。一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素GＡ3的活性仅及不经高温灭菌的新颖溶液的1０%。蔗糖经高温后部分被降解成Ｄ-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培育的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反应。IＡＡ，NAA,2,4－Ｄ、感动素和玉米素在高温下是比较稳定的。维生素具有不同程度的热稳定性，但假如培育基的ＰH值高于5.５，则维生素B1会被快速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌,不能高温灭菌，否则会失去作用。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米以下,当溶液通过滤液后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。过滤除菌操作步骤:首先将过滤器、接液瓶用纸包好,滤膜可放在培育皿内用纸包好。使用前先经１２1℃高压蒸汽灭菌3０分钟；在超净工作台上，将滤器装置装好,用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面对上；然后将待除菌的液体注入滤器内,开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培育证明无菌生长后可保存备用。5、空间接受紫外线和熏蒸灭菌(１）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸取紫外线后，蛋白质很核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为２0０－30０ｎm,其中２６0nm的杀菌力量最强,但是由于紫外线的穿透力量很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过１.2米为宜。(2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态集中到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞裂开或溶解。一般说来,温度越高，作用时间越长,杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必需溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌力量越强，但石炭酸和酒精例外。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时,房间关闭紧密,按5-８ml／ｍ３用量,将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。６、一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂搽，喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用７５%的酒精反复涂搽灭菌,1%-2％的来苏儿溶液以及0．２５％-1%的新洁尔灭也可以。7、植物材料表面用消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培育基,便会造成培育基污染。因此,植物材料必需经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接种到培育基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(expｌaｎt)。首先，将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分认真洗洁净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂移或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严峻时特殊有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最抱负的清洗物质是表面活性物质吐温。其次步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，预备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用7０%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,假照实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用7０%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可依据状况选取１-2种使用见下表。常用灭菌剂使用浓度及效果比较表灭菌剂名称使用浓度％消毒难易灭菌时间灭菌效果酒精７０-75易０．１-3好氯化汞0．1-0.2较难2-1０最好漂白粉饱和溶液易5－30很好次氯酸钙9-１0易5-30很好次氯酸钠2(活性氧)易5－3０很好过氧化氢１０-12最易５－１5好抗菌素4-50mｇ/Ｌ中3０-60较好上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3-４次即可;由于升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8-１0次,每次不少于3分钟,以尽量去除残毒。灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前１-2分钟，开头把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要留意勿使材料倒出，氢净后马上倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开头,至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液,切勿牵强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。在灭菌溶液中加吐温－8０或TｒitoｎＸ效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更简洁浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的损害也在增加，应留意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在10０ml加入１5滴。最终一步是用无菌水漂洗,漂洗要求3分钟左右，视接受的消毒液种类，漂洗３-1０次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。灭菌原理紫外线灭菌的原理：紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在2２０-30０纳米的紫外线称为“杀生命区”,其中以2６0钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DＮA，使DＮA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体)，抑制了ＤＮＡ复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有肯定的杀菌作用。紫外线透过物质的力量很差,适用于空气及物体表面的灭菌,与被照物的距离以不超过1.2米为易,照射时间以视紫外线灯管的功率大小、被照空间及面积大小,依据灭菌效果测定结果而定。由于紫外线对