第九章基因工程和基因组学

第九章基因工程和基因组学第一页，共六十页，2022年，8月28日

基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。第二页，共六十页，2022年，8月28日第三页，共六十页，2022年，8月28日

基因工程的施工程序大致分为四个步骤：

1、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。

2、把目的基因与载体结合成重组DNA分子。

第四页，共六十页，2022年，8月28日3、把重组DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系(Clone)或称克隆。

4、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。

第五页，共六十页，2022年，8月28日二限制性内切酶

细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源DNA分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是一种水解DNA的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。

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在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，因此称为粘性末端。

第八页，共六十页，2022年，8月28日第九页，共六十页，2022年，8月28日第十页，共六十页，2022年，8月28日三载体 (一)质粒 质粒是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状DNA。一般有1～200Kb左右(Kb为千碱基对)它的DNA分子很小，一般为细菌染色体DNA的0.5～3%。

第十一页，共六十页，2022年，8月28日第十二页，共六十页，2022年，8月28日λ噬菌体 λ噬菌体基因组全长49kb,其核酸序列及基因功能和表达调控已研究得十分清楚。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为DNA左、右臂。研究表明，λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。

第十三页，共六十页，2022年，8月28日第十四页，共六十页，2022年，8月28日(三)柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9－5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)，细菌质粒的复制原点。第十五页，共六十页，2022年，8月28日第十六页，共六十页，2022年，8月28日(四)穿梭载体穿梭载体(shuttlevectors)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。第十七页，共六十页，2022年，8月28日第十八页，共六十页，2022年，8月28日(五)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)载体就是为了克隆更大的外源DNA片段而设计构建的。BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。第十九页，共六十页，2022年，8月28日第二十页，共六十页，2022年，8月28日(七)Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。第二十一页，共六十页，2022年，8月28日第二十二页，共六十页，2022年，8月28日四筛选基因库(一)从基因库中分离基因 基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。第二十三页，共六十页，2022年，8月28日从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。1.构建基因库 (1)核基因库第二十四页，共六十页，2022年，8月28日核基因库(genomiclibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。第二十五页，共六十页，2022年，8月28日

通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体连接构成重组DNA分子,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。

第二十六页，共六十页，2022年，8月28日(2)染色体基因库将基因组的一部分如一根染色体用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。第二十七页，共六十页，2022年，8月28日(3)cDNA库cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。第二十八页，共六十页，2022年，8月28日第二十九页，共六十页，2022年，8月28日第三十页，共六十页，2022年，8月28日

2.筛选基因库从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，作探针，筛选基因库第三十一页，共六十页，2022年，8月28日第三十二页，共六十页，2022年，8月28日3.阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。第三十三页，共六十页，2022年，8月28日①限制性酶图谱构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。第三十四页，共六十页，2022年，8月28日图9－12表示一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。第三十五页，共六十页，2022年，8月28日

这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的DNA转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X-光片放射自显影检测杂交信号②核酸分子杂交Southern杂交分析(Southernblotting)是基因工程中常用的方法。第三十六页，共六十页，2022年，8月28日第三十七页，共六十页，2022年，8月28日③核酸序列测定只有将克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由Sanger于1977年发明的双脱氧核糖核酸链终止法。第三十八页，共六十页，2022年，8月28日第三十九页，共六十页，2022年，8月28日④核酸序列分析测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。第四十页，共六十页，2022年，8月28日(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因聚合酶链式反应(polymerasechain)

PCR反应包括三个步骤：变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-70℃。延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链。第四十一页，共六十页，2022年，8月28日第四十二页，共六十页，2022年，8月28日(三)人工合成基因根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。第四十三页，共六十页，2022年，8月28日第四十四页，共六十页，2022年，8月28日第二节基因组学基因组学(genomics)是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组(genome)的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基因。第四十五页，共六十页，2022年，8月28日第四十六页，共六十页，2022年，8月28日

1、基因组图谱的构建第四十七页，共六十页，2022年，8月28日

在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环a、克隆连续序列法(clonecontig)，将基因组DNA切割长度为0.1Mb-1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上，分别测定单个克隆的序列，再装配、连接成连续的DNA分子。第四十八页，共六十页，2022年，8月28日b、定向鸟枪射击法(directedshotgun)，以基因组图谱中的标记为依据，测序、装配和构建不同DNA片段的序列。第四十九页，共六十页，2022年，8月28日(一)遗传图谱图谱标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)，在构建遗传图谱中，可用基因和DNA作为标记。第五十页，共六十页，2022年，8月28日

第五十一页，共六十页，2022年，8月28日(1)基因标记

基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记

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(2)DNA标记A、限制性内切酶多型性B、简单序列长度多型性a、多次重复序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTRs)，也称为微随体(minisatellite)。这种重复序列长度为几十个核苷酸。b、简单重复序列(simpletandemrepeats，STRs)又称为小随体(microsatellite)。第五十三页，共六十页，2022年，8月28日C、单核苷酸多型性单核苷酸多型性(simplenucleotidepolymorphisms，SNPs)是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生RFLP，但多数突变不是发生在酶切位点。第五十四页，共六十页，2022年，8月28日遗传图谱的构建(1)人类基因组遗传图谱的构建(2)植物基因组遗传图谱的构建A、选择亲本第五十五页，共六十页，2022年，8月28日B、产生构图群体

第五十六页，共六十页，2022年，8月28日C、遗传标记的染色体定位

D、标记间的连锁分析第五十七页，共六十页，2022年，8月28日(二)物理图谱基因组物理图谱的构建不需要经过减数分裂的世代群体，可以直接利用DNA分子分析，主要有以下三种不同途径。1.限制性酶图谱

A、用识别较多核苷酸的内切酶

B、选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶。2.荧光原位杂交3.序列标签位点第五十八页，共六十页，2022年，8月28日(1)特异DNA序列A、表达