蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法

一、目的：初步把握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。Ve，Kav1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。二、原理：凝胶层析法〔即凝胶过滤法，gelfiltration〕是利用凝胶把分子大小不同的物质分别开的一种方法，又叫做分子筛层析法〔molecularsievechromatography〕，排阻层析法〔exclusionchromatography〕。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进展分别，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与一般的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，参加欲分别的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最终流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分别17-1。gelSepharose〕，人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶〔商品名Bio-gel-P〕和葡聚糖〔dextran〕Sephadex型的各种17-2所示。性质可分别不同分子量的物质。“总体积”Vt〔totalVtVo，ViVg三局部组成，即：Vt=Vo+Vi+VgVo称为“孔隙体积”或“外体积”〔outervolume〕又称“外水体积”，即存在于柱床Vi为内体积〔innervolume〕，又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积〔Ve，elutionVolume〕VoVi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自参加样品时算起，到组分最大浓度〔峰〕消灭时所流出Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的安排系数。细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过试验求得，上式可改写成：Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液〔200万的蓝色葡聚糖-2023等〕通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得〔g为干凝胶重，单位为”，以毫升/克表示〕Ve，就可算出它的Kd可以有以下几种状况：200万的蓝色葡聚糖-2023等〕通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得〔g为干凝胶重，单位为克；/克表示〕。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过试验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。Kd可以有以下几种状况：。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质〔全排阻〕，洗脱体积等于空隙体积〔图中组分Ⅰ〕。。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和〔图中组分Ⅲ〕。Kd都等于零，虽然分子大小Kd都等于1，它们既使分子大小有不同，也没有分别效果。因此不同型号的凝胶介质，有它肯定的使用范围。。表示内体积只有一局部可被组分利用，集中VeVo+Vi之间变化〔图中组分Ⅱ〕。Ve＞Vo+Vi。例如一些芳香Kd＞1。如苯丙氨SephadexG-25Kd1.2，1.42.2。Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差异G-10Kd0.75G-250.8左右。这是由于一部Vig·WR计算，为此也常有直接用小分子物质Vi值的。另一个解决的方法是不使用Kav〔有效安排系数〕Kd〔Vi〕改为水与凝胶颗粒〔Vi—Vo〕作为固〔Ve—Vo〕作为流淌相。KavKd对交联度小的凝胶差异较小，而对交联度大的凝胶差异大。Vt体积后，全部的组分都应当被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1—K2logMrVe—Vo〔分别体积〕，Ve/Vo〔相对〕，Ve/Vt〔简化的洗脱体积，它受柱的填充状况的影响较小〕或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作“选择曲线”17-5所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要打算于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特别的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线局部为宜。分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的局部，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。pH6—8的范围内，线性关系比较5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合测分子量的结果，要和其它方法的测定相比照，由此才可作出较牢靠的结论。凝胶层析技术操作便利，设备简洁，周期短，重复性能好，而且条件温顺，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分别提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的分子量。下面试验是用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。三、试剂及器材：1、试剂：标准蛋白质混合液〔各2—3mg·ml-1，用氯化钾-乙酸溶液配制〕，牛血清〔Mr43000〕，A〔Mr25000〕〔PH2Mr12023〕等均需层析纯。蓝色葡聚糖-2023〔8—10mg·ml-1〕，N-乙酰酪氨酸乙酯〔或硫酸铵或重铬酸钾〕〔8—10mg·ml-1〕。〔3〕0.025mo·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，SephadexG—75〔或G—100〕，5%Ba〔Ac〕2。〔4〕待测蛋白质样品液。2．器材：90~100cm〕，核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动局部收集器，恒压瓶，下口瓶。四、操作步骤：1、一般操作方法：凝胶的选择和处理用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。〔一般多用水，盐溶液或缓冲溶液〕中，室温下度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100℃，这样可大大缩短胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。装柱〔17-6〕。装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内参加约1/3柱容积的洗2—3cm后，翻开柱的出口，调整适宜的流速，使凝胶连续沉集，待沉集5cm处时停顿装柱，关闭出水口。接着再通过2—3防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。-2023〔又称蓝Bluedextran-2023〕C等配成是否均匀，有无“纹路”或气泡。假设层析柱床不均一，必需重装柱。加样1—2ml/100ml柱床容积〔1—2%〕；制备用量：20—30ml/100ml柱床容积。加样方法与一般柱层析一样。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压转变，50cm处〔SephadexG-7550cm液柱操作压〕，翻开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液留神加到凝胶床面上，应避开将床面凝胶冲起，翻开下口夹,夹紧1ml23—4ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测〔17-7〕。洗脱洗脱液应与凝胶溶胀所用液体一样。洗脱用的液体有水〔多用于分别不带电荷的中性物质〕及电解质溶液〔用于分别带电基团的样品〕，如酸、碱、盐的溶液及-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以削减吸附，将组分洗下。本试验洗脱用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液。洗脱时，翻开上、下进出口夹子，用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，3ml/10min流速洗脱，用自动局部收集器收集流出液。影响洗脱液流速的因素有：——操作压〔由液面差引起〕。一般来说，流速与柱压不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小〔WR＞7.5〕的凝胶时要特别留意。为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。②凝胶交联度；交联度大的凝胶〔G-10G-50型〕的流速与柱的压力差成正〔G-75G-200型〕的流17-8。③凝胶颗粒大小：颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小致太慢，以免用时过长。重装一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特别的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，经沉集、平衡后即可使用。凝胶的保存方法凝胶用完后，可用以下方法保存。①膨胀状态：即在水相中保存。可按留意事项〔9〕，参加防腐剂或加热灭菌后60%—70%乙醇洗，则95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60—80℃枯燥后保存。这3种方法中，以枯燥状态保存为最好。2．蛋白质分子量测定G-75G-100型凝胶，其颗粒在1.0—1.3cm90—100cm，本试验选用1.1×100cm商品层析柱。VoVi将0.5ml蓝色葡聚糖-2023和硫酸铵混合液〔2mg·ml-1〕上柱、洗脱，分别测出VeVoVeVo即为柱的Ba〔Ac〕2生成沉淀推断〔假设用重铬酸钾，其洗脱峰，可依据颜色推断〕。标准曲线的制作按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液洗脱。流速3ml/10min，3ml/管。用局部收集器收集，核酸蛋280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸取值。以管号〔或洗脱体积〕为横坐标，光吸取值为纵坐标作出洗脱曲线。依据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积〔Ve〕。然后，以蛋白质分子量的为横坐标,作出标准曲线〔17-9〕。为了结果牢靠，应1—2Ve的平均值作图。同时依据已测出的VoVi以及VtKdKav。KdKav为横坐标，1gMr为纵坐标作出标准曲线。未知样品分子量的测定五、结果与争论：1—2次，取其平均值，Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。重量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。层析柱粗细必需均匀，柱管大小可依据实际需要选择。一般来说，瘦长的柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心局部的组分移动慢，而管壁四周分别效果反而不好。用于脱盐的柱一般都是短而粗，柱长〔〕/直径〔〕＜10；对分级分别用的柱，L/D值可以比较大，对很难分别的组分可以到达L/D=100，一般选用内径为1cm100cm就够了。各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。气之处，应认真检查并加以订正。装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜凝胶床高度下降。始终保持柱内液面高于凝胶外表，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液得不重装柱。样品上柱后，样品分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形显得宽而矮，有些可分别的组分也因此重叠。容积变化，从而影响分别效果。Vt，Vo，Ve等也转变，造成试验结果的误差。防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠〔NaN3〕溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反响，也不转变它们的层析效果，也可用0.002%的洗必泰〔hibitane〕溶液。在弱酸性溶液中，可用0.05%〔或0.01%—0.02%〕三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60℃以上时就要分解。在弱碱性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。由于它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。17-1。产生的原因1．恒压瓶上口或下口橡胶塞未塞紧或橡胶塞插玻璃管处漏气找出漏气缘由，塞紧橡胶塞层析柱连接后，进水口无液体滴出层析柱进水口或出水口的止水夹未翻开进水口塑料管中有气泡翻开止水夹排解塑料管中的气泡层析柱出水口无液体流出层析柱下口螺丝未旋紧，因漏气而造成出水塑料管中有气泡出水口塑料管被凝胶堵塞翻开出水口止水夹并调整流速找出产生气泡的缘由，排解气泡层析过程中流速渐渐减慢7．样品中或洗脱缓冲液中含有不溶颗粒将胶床外表堵塞操作压过高，将凝胶胶床压紧测定内水时硫酸铵浓度太大；凝胶脱水使胶床压紧加样时未留意恒压，加样后胶床床面下降长期使用，微生物生长装柱时凝胶未完全溶胀，平衡时流速即渐渐减慢凝胶颗粒过细，或由于用暴力搅动凝胶使凝胶颗粒打碎1—2cm的凝胶，补加凝胶至同样高度重装柱，承受适当的操作压将凝胶取出用缓冲液反复洗涤，溶胀重装柱。适当降低硫酸铵浓度加样时应依据操作压，将塑料管下水口抬高至相应的操作压层析柱不用时，在平衡缓冲液中参加0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰，并使其布满柱床体积，以抑制细菌生长，临时不用的柱应定期用缓冲液过柱冲洗，也可以防止微生物生长将凝胶取出，待其完全溶胀后重装柱止暴力层析柱胶床中有气泡装柱前，凝胶未抽气或煮沸，在凝胶中混入空气加样不当使空气进入凝胶胶床从冰箱中取出凝胶或凝胶缓冲液马上装柱，或装柱后被太阳暴晒14．在凝胶柱上层的气泡可用细头长滴管或细塑料管将气泡取出或赶走，并重平衡，稳定胶床后再使用，假设气泡太多则应抽气或煮沸后自然冷却后装柱15．留神加样防止带进气泡层析柱胶床裂开大量空气进入层析柱进水口流速慢，出水口流速快找出空气进入层析柱的缘由，重装柱样品进入凝胶后条带扭曲样品或缓冲液中有颗粒或不溶物凝胶外表不平，或胶床不均匀按方法7处理样品或缓冲液将凝胶柱置于垂直位，轻轻搅动胶床外表1—2cm处的凝胶，使其自然沉降凝胶层析区分率不高凝胶层析柱装得不均匀G型选择不当加样量太大柱床