牛血清白蛋白含量标准曲线课件

实验一

还原糖的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）

东北大学生命科学与健康学院

实验室安全守则

一、实验课规则

1、实验室是师生进行实验教学的活动场所，学生进入实验室后要保持肃静，遵守纪律。提前5分钟进入实验室。

2、做实验前，认真听教师讲解实验目的，步骤，仪器的性能操作方法和注意事项、认真检查所需仪器设备，药品是否齐全、完好，如有缺损要及时向教师报告。

3、实验时要遵守操作规程，按照实验步骤认真操作，严禁违规操作，严禁未经教师指导、许可私自操作。实验必须按步骤进行，并仔细观察，做好记录，课后及时写好实验报告。

4、实验过程中如发生故障或异常情况，应及时报告老师，防止意外事故发生。

5、应爱护实验器材，爱惜药品，不随意玩弄器材药品。实验完毕，应及时洗涤器皿，并把器材、药品按规定位置放好，严禁私自带走器材、药品。

6、实验结束，要将仪器整理成洗净，保持桌面，室内的整洁，认真清理仪器设备，关闭水源电源。由老师检查后才能离开。

实验室安全守则

二、安全用电原则：

1、不要私自连接实验桌上的插头、插座．不要私自拆卸实验桌上的插头、插座。

2、使用学生电源时，打开开关之前检查是否已将用电器连入电路中，如果没有，须重新连接电路。

3、如果发现电线绝缘层已损坏，须告知实验老师，切不可用手直接接触。

三、使用化学药品制度：

1、取用固体化学药品用药匙，不可用手拿。

2、取用少量液体药品用滴管，大量使用时口对口倾倒，一定要胆大心细。如不慎手上粘有药品。应立即用水冲洗。

3、如果不慎将腐蚀性试剂滴到手上，应立即用抹布擦干，再用大量的水清洗。若不慎溅入眼中，应立即用清水冲洗，并告知实验老师。

一、目的

?掌握还原糖定量测定的基本原理；

?学习比色定糖法的基本操作；

?熟悉分光光度计的使用方法。

二、原理

还原糖：具有还原性的糖类。分子中含有游离醛基或羰基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。常见的有葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖等；

碱性条件

还原糖＋3,5-二硝基水杨酸

加热

3-氨基-5-硝基水杨酸＋糖酸

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系（540nm波长吸收）；

淀粉中所含各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖；利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：面粉

仪器：

1、25mL刻度试管(9个);2、大离心管(2个);3、100mL烧杯(1个);4、100mL容量瓶(1个);5、1mL,2mL,20mL刻度吸管各一个;6、恒温水浴锅;7、离心机;8、电子天平;9、分光光度计;

试剂:（1）1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖，置于小烧杯中，用少量蒸馏水熔解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g3,5二硝基水杨酸和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

四、实验步骤

葡萄糖标准曲线制作：

取7支试管，编号，按表1-1所示的量，精确加入葡萄糖标准液和3,5－二硝基水杨酸及蒸馏水，摇匀，沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管加入21.5mL蒸馏水，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀，在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

表1-1葡萄糖标准曲线的测定

项目

管号

0葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)3,5－二硝基水杨酸试剂(mL)02.01.510.21.81.520.41.61.530.61.41.540.81.21.551.01.01.561.20.81.5?样品中还原糖的提取：

称取3g食用面粉，放在100mL的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50oC恒温水浴中保温20min，搅拌，使还原糖浸出，离心（4000rpm10min），用20mL蒸馏水洗，混匀残渣，再离心，将两次离心的上清液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀，作为还原糖待测液。

?显色和比色：

取2试管，编号，按表1-2所示的量，精确加入待测液和试剂。加完试剂后，其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同，测定各管吸光值。

表1-2还原糖含量的测定

项

目

编号

还原糖待测液（mL）

蒸馏水（mL）

3,5－二硝基水杨酸试剂(mL)还原糖测定管号

①

②

22001.51.5五、结果与计算——实验数据记录表

测定次数

各管A值（吸光度）

1234567123平均值

用各管平均A值（吸光度）绘制标准曲线图

五、结果与计算

?以管①、②的吸光值平均值，分别利用标准曲线所求得的公式计算出还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖的百分含量。

提取液总体积查曲线所得还原糖毫克数?测定时取用体积还原糖%??100样品毫克数思考题

1．使用紫外分光光度计时应注意哪些事项？

2．思考在没有离心机的情况下怎样设计一套方案完成本实验?

3．为什么标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色？

4．关于糖的测定除了本实验中涉及的水杨酸比色法还有另一种蒽酮比色定糖法，查找相关资料，比较两种方法有何异同？

实验二

可溶性糖的硅胶G薄层层析

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?了解薄层层析的一般原理；

?掌握硅胶G薄层层析的基本技术及其在可溶性糖分离鉴定中的应用。

二、原理

植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，并可通过一定的手段，去除蛋白质，获得较纯的可溶性糖的混合液。

糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G层上迁移时，与硅胶分子间有一定吸附力，糖羟基多少不同，与硅胶吸附力存在差异，该吸附力的大小顺序为：三糖＞二糖＞已糖＞戊糖。

极性不同的糖在硅胶G层上展层时，迁移率(Rf)不同，通过与已知糖的Rf相比较，可分离鉴定植物样品提取液中糖的种类。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：苹果

仪器：1、离心机及大离心管；23、研钵；45、量筒：25mL,10mL；7、层析缸；89、玻璃板7.5×15cm；

、药物天平；

、蒸发皿；

、恒温水浴锅；

、微量点样管(毛细管)；

、吹风机、喷雾器、烘箱；

610

试剂

（1）95%乙醇

（2）80%乙醇

（3）10%Pb(Ac)2

（4）饱和Na2SO4

（5）氯仿

（6）冰乙酸

（7）1%标准糖溶液(10mg/mL)：木糖，果糖，葡萄糖，蔗糖（8）苯胺-二苯胺-磷酸显色剂：2g二苯胺，加2mL苯胺，酸，1mLHCl，100mL丙酮，溶后摇匀，置于棕色瓶中。

10mL85%磷

四、实验步骤

1．硅胶G薄板的制备

称取硅胶G粉3.5g，羧甲基纤维素纳0.03g，加入0.1M硼酸溶液9-12mL，于研钵中充分研磨，待硅胶G开始变稠时,

倾入玻璃板上(7.5×15cm)，快速铺板，并震荡均匀，铺层后的薄板放置在实验台上，用前于110oC烘箱中活化1h。

实验步骤

2．苹果中可溶性糖提取液的制备：

洗净苹果，去果皮，称5g果肉，在研钵中将果肉磨成匀浆，装入大离心管中，用20mL95%乙醇，洗涤研钵，洗涤液加入离心管中，浸提30min，然后3500rpm，离心10min，上清液倾入另一大离心管中，残渣加5mL80%乙醇洗涤，离心取上清液。重复两次，合并上清液，于70oC水浴上预热上清液，趁热逐滴加入10%中性醋酸铅溶液，沉淀蛋白质。然后再逐滴加入饱和硫酸钠，沉淀多余的铅，3500rpm，离心10min，收集上清液，放入蒸发皿中，飘在水浴锅中。于70oC水浴上蒸干，析出物质以3～5mL蒸馏水溶解，即得糖抽提液。

实验步骤

3．苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定：

取活化过的硅胶G玻板一块，在距底边1.5cm水平线上确定5个点，相互间隔1cm，其中4个点分别点上木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖标准溶液适量，另一个点点上苹果提出液适量，以氯仿∶冰乙酸∶水=30∶35∶5为展层剂，将玻璃板放入层析缸中展层。当展层剂前沿达距薄板顶端约1cm处，停止层析，取出玻璃板以吹风机吹干。然后以苯胺-二苯胺-磷酸喷雾，于85oC烘箱中烘10min，各种糖即显出不同颜色，与标准糖比较，根据色斑颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖种类。

五、结果与计算

?显色后照相或绘图记录层析图谱，也可用CS-930进行扫描其展层图谱。

Rf（值）=溶质斑点中心到点样点的距离

溶剂前沿到点样点的距离

思考题

1．本实验中薄层层析的原理是什么?2．影响Rf值的因素有哪些？

3．根据薄层层析原理，选择展层溶剂时应注意些什么？

4．查找相关资料，熟悉用薄层层析方法分离各类物质常用的固定相、流动相和显色剂？

实验三

酵母核糖核酸的提取

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识；

二、原理

酵母核酸中主要是RNA(2.67～10.0%)，DNA很少(0.03～0.516%)，而且菌体容易收集，RNA也易于分离。

RNA提取方法：先使利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。

该方法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20～27oC之间停留时间过长，因为磷酸二酯酶和磷酸单酯酶在该温度范围活性较高，会使RNA降解进而降低提取率。

加热至90～100oC可使蛋白质变性，破坏该类酶，有利于RNA的提取。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：干酵母

仪器：1、50mL量筒；2、100mL烧杯；

3、250mL，50mL，10mL烧杯；

4、40mm布氏漏斗；5、125mL吸滤瓶；

6、6cm表面皿；7、UV-5200紫外分光光度计；

8、离心机；9、恒温水浴；

11、烘箱

10、药物天平；

试剂

（1）（2）（3）

（化学纯）

乙醇（化学纯）NaCl6mol/LHCl95%

四、实验步骤

1．RNA提取

称取干酵母粉5g，倒入100mL烧杯中，加NaCl5g，水50mL，搅拌均匀，置于沸水浴中提取1h。

2.RNA与菌体分离

将上述提取液取出，用自来水冷却，装入大离心管内，以3500rpm离心10min，留取上清，使提取液与菌体残渣等分离。

实验步骤

3．沉淀RNA

将离心得到的上清液倾于100mL烧杯中，并置于放有冰块的250mL烧杯中冷却，待冷至10oC以下时，用6mol/LHCl小心地调节pH至2.0～2.5，随着pH下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH），调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。

实验步骤

4．洗涤和抽滤

上述悬浮液以3500rpm离心10min，得到RNA沉淀，将沉淀物放在10mL小烧杯内，用95%的乙醇5～10mL充分搅拌洗涤，在布氏漏斗上用水泵抽气过滤后，用95%乙醇5～10mL淋洗3次。

由于RNA不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯度。

实验步骤

5．干燥

从布氏漏斗上取下沉淀物，放在表面皿上，铺成薄层，置于80oC烘箱内干燥（约10min)，将干燥后的RNA制品称重。

6．含量测定

将干燥后的RNA产品用500mL容量瓶定容，配制成浓度为40～80μg/mL的溶液，用蒸馏水作空白，在分光光度计上测定其260nm处的吸光度，如果产物较多超过范围,可以定容后再稀释,但是计算时要乘上稀释倍数

五、结果与计算

?按下式计算RNA含量

A260RNA溶液总体积(ml)RNA含量(%)???稀释倍数?1000.024?LRNA称取量(?g)式中：A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为1mL溶液含1μg

RNA的吸光度。?根据含量测定的结果按下式计算提取率：

RNA含量(%)?RNA制品重(g)RNA提取率(%)?酵母重(g)思考题

1.本实验为什么选择酵母作为提取RNA的材料？

2．用浓盐法提取RNA的原理是什么？

3．提取制备RNA常用的方法是哪几种？各自原理？有何优点？

4．制备RNA应注意哪些问题？

实验四DNA琼脂糖凝胶电泳

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?学习并掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作；

?通过DNA琼脂糖凝胶电泳可知DNA的纯度、含量和相对分子质量。

二、原理

琼脂糖凝胶电泳是分子生物学中最常用DNA分离和鉴定方法，根据不同构像和分子量的DNA在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同进而对DNA进行分离和鉴定。

DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

?DNA分子在琼脂糖凝胶中的泳动速度与电荷、分子大小及构象有关。由于构成DNA的糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此能以同样的速度向正极移动。泳动速度与DNA分子相对分子质量的对数成反比；

?DNA分子的构象也影响其迁移速度，同样相对分子量的DNA，超螺旋共价闭环质粒DNA迁移速度最快，线状DNA其次，开环DNA最慢。

琼脂糖含量/%

0.5

0.7

最佳线性DNA分辨范围

1～30kb

0.8～12kb

1.01.2

1.5

2

0.5～10kb400～7000bp

200～3000

50～2000

?观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料溴乙锭染色，EB在紫外灯照射下，发出红色荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，荧光的强度正比于DNA的含量。

?GoldView?是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

?综上所述，通过DNA琼脂糖凝胶电泳可知DNA的纯度、含量和相对分子质量。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：质粒DNA，PCR产物

仪器：1、Eppendorf管2、Tip3、一次性手套4、移液器

5、锥形瓶6、量筒

7、微波炉8、稳压电泳仪

9、凝胶成像仪10、水平式电泳槽

11、天平12、制胶槽

试剂

（1）TAE缓冲液

40mMTris-乙酸盐，1mMEDTA(pH8.0)（2）凝胶加样缓冲液

0.2%溴酚蓝，50%蔗糖

：称取溴酚蓝200mg，加重蒸水10mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖50g，加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至100mL，加10MNaOH1～2滴，调至蓝色。

（3）琼脂糖

（4）

GoldView?

（5）DNA相对分子质量标准品(DL2000marker)（6）质粒及PCR产物

四、实验步骤

1．琼脂糖凝胶的制备

称取0.25g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入25mL1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴锅中加热至完全溶化，取出摇匀（看不见颗粒，也可以边加热边摇匀），琼脂糖终浓度为1%。待琼脂糖凝胶溶液冷却至约50oC，再加入GoldView?，摇匀。

实验步骤

2．凝胶板的制备

(1)将制胶槽置于水平位置。

(3)选择孔径适宜的梳子，垂直架在有机玻璃内槽的一端，使梳齿距玻璃板之间尚有约1.0mm的距离。

(4)将冷到50oC左右的琼脂糖凝胶，缓缓倒入有机玻璃内槽，厚度适宜(不要有气泡)。

(5)待凝胶凝固后，小心取出梳子，将胶放入电泳槽内，含上样孔的一端位于负极。

(6)加入足够的TAE电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面。

实验步骤

3．加样

取4μL待测质粒DNA，

加1μL溴酚蓝指示剂，混匀后用移液器将其加入加样孔(梳孔)，PCR产物直接取8μL加入上样孔，marker5μL加入上样孔记录样品点样次序与点样量。

4．电泳

(1)接通电泳槽与电泳仪电源(DNA片段从负极向正极移动)，DNA的迁移速度与电压成正比。

(2)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿约2cm处，停止电泳。

五、结果与计算

?在紫外灯下观察凝胶，有DNA处应显出橘红色荧光条带。PCR产物

质粒DNA记录电泳结果或直接拍照。

思考题

1．制胶过程应注意哪些问题？

2．结合实验过程总结点样的关键技术

3．你在紫外灯下都观察到什么了?怎么解释?

实验五

用DNS法鉴定蛋白质或多肽的N-端氨基酸

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?了解并掌握DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析鉴定蛋白质或多肽的N-端氨基酸。

二、原理

DNS-Cl在碱性条件下与蛋白质或多肽的N-端氨基结合生成DNS-蛋白质或DNS-多肽，再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，在紫外光照射下，产生强烈的黄色荧光，可用聚酰胺薄膜层析进行鉴定。

二、原理

DNS-Cl能与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基（epsilon-氨基）和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。

DNS-Cl在pH值过高时，水解产生副产物DNS-OH；DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，在紫外光照射下，DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，而DNS-氨基酸产生黄色荧光，能明显区分。

三、实验材料、仪器、试剂

仪器：2

4

67

1、层析缸

、聚酰胺薄膜(7cm×7cm)3、电吹风

、紫外灯

5、点样管

、50mL离心管

、水浴锅

试剂

（1）各种层析纯标准氨基酸

（2）DNS-Cl丙酮溶液：称取25mgDNS-Cl溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，1个月内有效。

（3）1M氢氧化钠

（4）展层剂：(Ⅰ)V(甲酸，88%)：V(蒸馏水)=1.5：100(Ⅱ)V(苯)：(冰醋酸)=9：1（5）溶解了氨基酸的碳酸氢钠溶液：称取2.5μmol层析纯的氨基酸，溶于0.5mL0.2M碳酸氢钠溶液。

四、实验步骤

1．DNS-标准氨基酸的制备

取2mL溶解了氨基酸的碳酸氢钠溶液于50mL的大试管中，加入2mLDNS-Cl丙酮溶液，用1M氢氧化钠溶液调pH至9.0～9.5，于室温避光反应2～4h，贮备于暗处。按后面所述的层析溶剂系统，做DNS-氨基酸的标准图谱。

2．样品的聚酰胺薄膜层析

取聚酰胺薄膜(7cm×7cm)一张，在距离相邻边缘各1.0cm处用铅笔画一相交直线，作为点样原点（毛面）。用点样管取上述DNS-氨基酸样品液进行点样，点样直径不超过2mm，可分几次点完，每次点后用冷风吹干再点下一次，吹干。

四、实验步骤

3．展层

光面向外卷曲(两边不相接触)，外扎牛皮筋。直立于盛有20mL展层剂的培养皿中，点样点置下端，置于展析缸中展层。

先放置于展层剂(I)中，到展层剂距顶端约0.3cm时，取出吹风机吹干(充分吹干)，然将膜翻转90oC后放入展层剂(Ⅱ)为第Ⅱ向，到展层剂距顶端约0.3cm时，取出吹干，到紫外灯下照相。

五、结果与计算

?在紫外灯下观察DNS-氨基酸的荧光斑点，对照标准图谱，在相应位置标出氨基酸名称。

思考题

1．DNS化测定N-末端的根据是什么？DNS化的最适pH值是多少？

2．DNS化的副产物是什么？如何除去？

3．DNS-Cl除能与α-氨基反应外，还能与氨基酸的什么基团发生反应？生成什么产物？

4．未知样品（蛋白质或肽）的N-末端氨基酸如何确定？

实验六Folin-酚法测定蛋白质含量

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

??掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法

。

?熟悉分光光度计的操作。

二、总蛋白测定经典和常见的方法比较

方

法

凯氏定氮法

双缩脲法

灵敏度

0.2～1.0mg氮

优

点

准确性好、精密度高、灵敏度高。

特异性高、准确度性好、精密度高、操作简单方便，显色稳定。

缺

点

操作复杂，费时

适用范围

用于标准蛋白质的定值、对其他方法校正等

为临床测定血清总蛋白首选方法。

1～20mg灵敏度低

Lowry法

（Folin-酚法）

紫

外

分光光度法

考马斯亮蓝法

（Bradford）

5～250ug灵敏度高、达双缩脲法的100倍。

干扰物质多、操作要求严格计时

适用于测定单一蛋白质及测定蛋白质含量较少的标本如脑脊液

常用于较纯的酶和免疫球蛋白测定

常用于需求更高呈色灵敏度的蛋白电泳

50～100mg快速简便、无损样品

灵敏度低、干扰物较多

不同蛋白质与染料结合力不一致，对比色杯有吸附作用

影响浊度大小因素多，如加试剂手法、反应温度等

1～5ug灵敏、简便、快速，干扰因素较少

化学比浊法

简便、不需特殊仪器

一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质含量较低的样品

三、原理

?1921年，Folin首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。

?1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。

三、原理

Folin-酚试剂法包括两步反应：

第一步：双缩脲反应——蛋白质肽键与铜离子形成络合物

蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物（蛋白质-Cu2+复合物）。且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在5～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、原理

第二步：络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色的磷钼蓝和磷钨蓝混合物；

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr)，故有此显色反应。即蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。颜色深浅与蛋白质含量成线性关系（正比）。故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显以强度稍有不同。

四、实验材料、仪器、试剂

实验材料：绿豆芽

仪器：1、分光光度计

2、离心机

3、分析天平

4、容量瓶（50mL）

5、量筒

6、移液管（1mL、5mL）

试剂

（1）0.5MNaOH（2）试剂甲

（碱性硫酸铜溶液）

（A）称取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。

（B）称取0.5gCuSO4?5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。

每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，混合，即为试剂甲，其有效期为1天，过期失效。

试剂

（3）试剂乙

（Folin-酚试剂）

将100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85%磷酸及100mL浓盐酸置于1500mL磨口圆底烧瓶中，混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL及液溴数滴，开口煮沸15min，驱除过量的溴(在通风橱内进行)。冷却，稀释至1000mL，过滤，滤液呈微绿色，贮于棕色瓶中，放置于冰箱中。

试剂

（4）牛血清白蛋白溶液标准液（250μg/mL）

在分析天平上精确称取25mg结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。

五、实验步骤

绿豆芽中蛋白的提取及测定：

（1）准确称取绿豆芽1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨。将匀浆转入离心管，并用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，并入离心管，4,000rpm离心20min，将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。

（2）取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲（碱性硫酸铜溶液）5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙（Folin-酚试剂）0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定吸光度，并记录结果。

五、实验步骤

标准曲线制作：取6支普通试管，按表9-1加入标准浓度的牛血清蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液，然后各加试剂甲（碱性硫酸铜溶液）

5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5mL试剂乙（Folin-酚试剂），立即混合均匀。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值并记录结果。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

表9-1牛血清白蛋白含量标准曲线

试

剂

250μg/mL牛血清白蛋白

(mL)蒸馏水

(mL)管

号

101.020.20.830.40.640.60.450.80.2610蛋白质含量

(μg)050100150200250六、注意事项IFolin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。

故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

七、结果与计算——实验数据记录表

各管A值（吸光度）

测定次数

112345623平均值

用各管平均A值（吸光度）绘制标准曲线图

七、结果与计算

?计算出两重复样品吸光度的平均值，根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中计算出样品溶液中的蛋白质含量；

?再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。

样品中蛋白质含量(%)?X(μg)?稀释倍数样品重(g)?106?100九、思考题

1．Folin-酚法的原理是什么？

2．有哪些因素可干扰Folin-酚法测定蛋白质含量？

3．为什么Folin-酚试剂乙要迅速混匀？

4．实验过程中那些环节应该特别注意？

实验七

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量的原理;??学会安装和使用垂直板型凝胶电泳装置;应用垂直型、SDS不连续系统凝胶电泳法、测定蛋白质的分子量。

二、原理

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法

(SDS)是一种基于蛋白质在电场驱动下，具有不同的移动能力进而对其进行分离的技术，与蛋白质多肽链的长度或分子量相关。

影响带电粒子电泳的内在因素有三点：分子所带净电荷、分子量大小和分子的形状。

十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate,SDS)，是一种很强的阴离子表面活性剂，SDS以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS-蛋白质复合物；

SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4∶1，这种高密度结合，远远超过了蛋白质原有的净电荷，从而消除了由于蛋白质所带净电荷的不同而对电泳迁移率产生的影响。

二、原理

由于SDS-蛋白质的复合物具有均一的电荷密度和荷质比，目前认为，SDS-蛋白质复合物具有扁平，紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，数量级在18?左右，与蛋白质的种类无关，棒的长轴是变化的，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量，因此SDS和蛋白质结合后所形成SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质形状的不同而对电泳迁移率的影响。

由于SDS和蛋白质的结合，消除了分子自身净电荷及分子形状两个因素的影响，使其电泳迁移率在外界条件固定的情况下，仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可通过与已知分子量的蛋白质分子迁移率进行比较，求出未知蛋白质的分子量。

二、原理

常用的凝胶SDS系统由浓缩凝胶和分离胶构成，浓缩胶其丙烯酰胺浓度为4-5%，分离胶浓度为8%-15%，浓缩胶的目的是让样品在浓缩层和分离层的界面压缩到一个超薄的区域（1-100nm），然后在进入分离胶对蛋白进行分离。

压缩原理：由于浓缩胶pH是6.8较低，甘氨酸在这里呈两性离子状态存在，所以这一层的离子强度较低，因此电阻较高，进而形成高电场力，使蛋白质的在堆集层的迁移速率高于分离层。同时由于浓缩胶孔径大，对一般蛋白质的迁移速率不造成影响；

因此当蛋白质到达堆积层和分离层边界时，分离层孔径小，首先到达边界的蛋白质速率便减慢，而后来的蛋白质仍然保持高速率迁移，便使得蛋白质在边界处堆积浓缩。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：蛋白质

仪器：1、垂直板电泳槽一套

2、稳流稳压电泳仪

3、移液器

4、水浴锅

5、

烧杯

试剂

（1）丙烯酰胺(Acr)凝胶贮液：22.2gAcr，0.6g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容到100mL，过滤后避光保存，4oC下可贮藏1-2个月。

（2）10%的SDS溶液

（3）10%的过硫酸铵溶液

（4）四甲基乙二胺(TEMED)溶液

（5）分离胶缓冲液：1.5mol/LpH8.8的Tris-盐酸缓冲液，将18.15gTris用水溶解后，用6mol/L的盐酸调至pH8.8定容到100mL。

（6）浓缩胶缓冲液：0.5mol/LpH6.8的Tris-盐酸缓冲液，将6gTris溶解后，用6mol/L的盐酸调至pH6.8，然后定容到100mL。

试剂

（7）电极缓冲液：将6gTris，28.8g甘氨酸和1gSDS加水溶解后，定容到1000mL，pH应为8.3。

（8）样品缓冲液(2x)：将1gSDS，2mLβ-硫基乙醇，5mL甘油，1.0mL0.1%溴酚兰和1mL试剂6，用水溶解并稀释到50mL。

（9）0.1%溴酚兰溶液

（10）已知分子量的标准蛋白（marker)（11）未知分子量的蛋白质样品

（12）考马斯亮兰染色液，称取0.25g考马斯亮兰R250加入45mL甲醇，10mL冰醋酸和45mL水。

（13）脱色液：37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水到500mL。

四、实验步骤

1．电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，洗涤干净，然后用水冲洗去除洗涤剂，再用蒸馏水冲洗，直立干燥。将干燥的玻璃板装入制胶架中，再插入三角形支架，安放在制胶底座上，将制胶底座上的旋钮旋到相应的位置（1.5mm厚的胶旋到1.5，1mm厚的胶旋到1.0)。

2.样品处理：蛋白液：样品缓冲液（v:v)=1:1混匀，总体积1mL。

在沸水浴中加热3-5min，蛋白质在SDS和β-硫基乙醇的作用下，变性，变成紧密的棒状SDS-蛋白质复合物。

凝胶制备：

?分离胶：按表12-1的配比制备分离胶(10%)。将Acr、水、tris缓冲液(pH8.8)、SDS，过硫酸铵和TEMED按表中的顺序和量加入到烧杯中，并混匀，混匀后将凝胶液沿玻壁缓缓地注入凝胶板中，注胶过程应防止气泡的产生，胶液加到距玻璃板顶部1.5-2cm处，立即用移液枪缓慢水平注入蒸馏水（或者异丙醇)。静置30min后，去掉水层，并用滤纸吸干水滴。

?浓缩胶：按照表12-1的配方制备浓缩胶。将Acr、水、tris缓冲液(pH6.8)、SDS，过硫酸铵和TEMED按表中的顺序和量比例加入到烧杯中，混匀，将胶液注入已吸去上层水的分离胶上，注满，然后立即将梳子插入凝胶板中，静置约30min后，小心地取出梳子。旋开旋钮，将制胶架从底座中取出，整个装置放入电泳槽中，向两槽内注入电泳缓冲液。

点样：

用微量注射器分别吸取marker10μL,样品20μL，分别注入到浓缩胶的上样孔中。

电泳：接通电源，立即电泳。红色电源线接入正极，黑色电源线插入负极，浓缩胶电压80v，当溴酚蓝迁移到界面时，电压换为140v，继续电泳，直到溴酚蓝到达凝胶底部，停止电泳。

染色：将凝胶板从电泳槽中取出，去掉浓缩胶，剥下凝胶，利用自来水简单冲洗凝胶后，将凝胶放入染液中，于30oC下染色约30min，以凝胶整体变蓝为宜。

脱色：染色后的凝胶用水冲洗去表面的染料，放入脱色液中，于37oC下脱色，脱色约需24h以上，其间要常更换脱色液。

五、结果与计算

与标准蛋白分子量相比较，大约算出未知样品的分子量。

电泳后凝胶

染色后凝胶

思考题：

1．SDS－PAGE测定蛋白质分子量的原理是什么？

2．本实验是否需在低温下进行？

3．样品溶解液中各种试剂的作用是什么？

4．影响实验误差可能的原因是什么？根据你的实验进行分析。

实验八

硝酸还原酶活性的测定

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?硝酸还原酶是植物中硝酸盐同化步骤的第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置，它与作物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活力被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。

?通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。

二、原理

硝酸还原酶可将NO3—还原成NO2—，

NO2—的生成量与硝酸还原酶NR活性相关。NO2—含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下NO2—与对-氨基苯磺酰胺发生重氮化反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐生成红色偶氮化合物，可在540nm下比色测定。

红色偶氮化合物

二、原理

硝酸还原酶活性一般采用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为NR粗酶液进行测定，由于研磨中NADH受损失，必须外加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定，环境中的NO3—进入细胞后，被NR还原成NO2—

，NO2—又扩散到细胞外并在溶液中积累，测定溶液中NO2—的含量即可得知NR活性的大小，活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应做一定数量的重复。本实验采用活体法。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：

植物的叶、茎、根、发芽种子、离体的胚、培养细胞等，均可作提取硝酸还原酶NR的材料。本实验选用发芽5～6天的小麦幼苗叶片。取样前须将幼苗移入0.05MKNO3溶液中（pH约6.0）诱导24h，并在取样前照光3h，切勿在暗期中取样。

仪器：1、紫外分光光度计

2、真空泵和真空干燥器

3、恒温水浴

4、刻度吸管（0.5mL，1mL，2mL）

5、天平

6、离心机

试剂

（1）0.1MKNO3：称取3.03gKNO3溶于300mL0.1MpH7.5的磷酸缓冲液中。

（2）1%磺胺：称取1g磺胺（NH2C6H4SO2NH2），溶于100mL3MHCl中。

（3）0.02%N-1-萘乙二胺盐酸盐：取0.02gN-1萘乙二胺盐酸盐（C12H14N2?2HCl）溶于100mL蒸馏水中，盛于棕色瓶避光保存。

（4）30%三氯乙酸：30g三氯乙酸溶于100mL蒸馏水中。

（5）NaNO2标准液：精确称取1gNaNO2用蒸馏水溶解后定容至1000mL，然后吸取5mL，再用蒸馏水稀释成1000mL，即为浓度5μg/ml的NaNO2标准液。

四、实验步骤

1．活体法测定硝酸还原酶活性

将小麦幼苗叶片洗净、擦干，剪成0.5cm的段，称取鲜样4份，每份1g，分别放入4个编号的试管。1号管先加1.0mL30%三氯乙酸，再向各管分别加入9.0mL0.1MKNO3溶液，混匀，放入真空干燥器，抽气、放气数次，以排出组织间隙的气体，使底物溶液进入组织，当所有的叶片都浸入溶液之后，将试管置暗处25oC下保温30min，取出试管，向2号管各加1mL30%三氯乙酸终止酶促反应。吸取2mL上清液于另一试管，各加2mL1%N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液，1%磺胺2mL，室温显色20min后，540nm波长下测定，用2、3、4号管吸光度平均值与1号管（对照）吸光度之差，在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（μg），然后代入公式计算。

2．标准曲线的制作

取8支干净试管，编号，按表14-1所示试剂：

表14-1NO2含量标准曲线

试

剂

NaNO2标准液(mL)蒸馏水(mL)每个试管中NaNO2含量(μg)

1%磺胺(mL)N－萘乙二胺盐酸盐(mL)管

号

102.002220.41.622230.81.24摇匀

2222222241.20.8651.60.4862.0010摇匀，室温下放置20min后，在540mm波长下测定。以NaNO2含量（μg）为横座标，吸光度值为纵座标，绘出标准曲线。

五、结果与计算——实验数据记录表

各管A值（吸光度）

测定次数

123456123平均值

用各管平均A值（吸光度）绘制标准曲线图

五、结果与计算

?把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入正式计算硝酸还原酶活性：

NaNO2含量(μg)?稀释倍数NR活性[NaNO2

(μg)/鲜重(g)?小时]＝

样品重(g)?时间(小时)

?式中稀释倍数对于活体法，指酶促反应液体积（10mL）与显色取用体积（2mL）之比，即等于5。

附注：

（1）无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。

（2）活体法酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸还原酶把NO2还原成NH3。

（3）提取缓冲液中加入半胱氨酸为的是保护酶分子中的巯基使之不易失活。

思考题：

1．测定硝酸还原酶依据的原理什么？

2．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应该在晴天进行？

3．测定硝酸还原酶活性的离体法和活体法各有何特点？

4．提取缓冲液中为什么加入半胱氨酸？

实验九

凝胶层析法分离提取

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶

东北大学生命科学与健康学院

一、目的

?掌握凝胶层析法原理；

?学习用凝胶层析法分离提取1,5-二磷核酮糖羧化酶的操作方法和实验技术。

二、原理

凝胶层析，又叫分子筛层析，是一种液相层析，机理是分子筛效应。凝胶层析是指混合物（溶液）随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各种物质因分子大小不同而被分离的技术。其中的流动相一般是缓冲液或其它特定的溶液，固定相是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶等。

适用于蛋白质纯化，蛋白的浓缩和脱盐，被广泛用于蛋白质的分离纯化中。二、原理

分离原理：当含有各种物质的样品溶液缓慢流经凝胶析柱时，各物质在柱内同进行着两种不同的运动，垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径很大，随洗脱溶液一起移动，所以向下移动的速度较快；较小分子量的物质既可以在凝胶颗粒间隙中扩散，还会进入到凝胶颗粒的微孔中进行扩散，因此使得小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使得样品的物质按分子量的大到小顺序流出柱外而得到分离。分离效果常用洗脱曲线表示。

二、原理

商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构；不溶于水，亲水性很强，由于它的分子中存在许多羟基，在水本实验中采用的葡聚糖凝胶，是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，中吸水形成凝胶并剧烈膨胀，从而能起分子筛的作用，以此来分离不同分子量的物质。

本实验用凝胶层析法分离提纯1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，该酶是光合作用中的重要酶系，其分子量约为5×105-6×105，由大小两种亚基组成，在叶绿体中1,5-二磷核酮糖羧化酶（RuBp羧化酶）含量很多，约占叶绿体间质蛋白的50%以上。

三、实验材料、仪器、试剂

实验材料：菠菜叶

仪器：1、Sephadex凝胶层析柱1套2、组织捣碎机一台

3、离心机一台4、自动收集器一台

5、紫外检测仪6、恒温水浴一台

7、不锈钢剪刀一把8、蠕动泵一台

9、天平10、纱布

11、硅胶管12、橡胶管

13、100mL量筒一支，5mL移液管一支，1mL移液管2支，250mL、500mL烧杯各一支

、100mL试剂

（1）Tris-HClpH7.4(包括两种)①缓冲液A：内含0.05mol/LTris-HCl，1.0mol/LNaCl，1mmol/LEDTA，0.002mol/LMgCl2，0.08mol/Lβ-巯基乙醇。

②缓冲液B：内含25mmol/LTris-HCl，0.2mol/LNaCl，0.5mmol/LEDTA（2）(NH4)2SO4

（3）SephadexG50四、实验步骤

1．粗酶提取液的制备(所有学生分四组)

取无病新鲜菠菜展开叶50g，洗净后用滤纸吸干水，剪碎，加入缓冲液A100mL，用组织捣碎机捣成匀浆，用4层纱布挤压过滤，滤液置于烧杯(250mL)中，在55oC恒温水浴上保温维持5min，然后冷却到20oC，用离心机以4500-5000rpm的速度离心20min，小心倒出上清液，弃去残渣，量准上清液体积，计算出该体积的35%饱和度所需(NH4)2SO4的用量(参见硫酸铵饱和度的常用表)，搅拌慢慢加入(NH4)2SO4，4500-5000rpm离心20min收集上清液；上清液再加(NH4)2SO4至65%饱和度(参见硫酸铵饱和度的常用表)，离心收集沉淀，弃去上清液；将沉淀溶于5mL缓冲液B中，通过上述过程得到了粗酶提取液。

调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25℃)硫酸铵终浓度，

％饱和度

10202530333540455055606570758090100每1L溶液加固体硫酸铵的克数①

056114144176196209243277313351390430472516561662767102025硫酸铵初浓度％饱和度

30

5786291185930137784919150916130183123936221615512594251189158127288225193162326262230198365300267235406340307273449382348314494424390356592694520619485583449